Ключевые слова
клеточная биология, каспазы, металлопротеиназы, цветные флуоресцирующие белки, молекулярный имиджинг, флуоресцентная микросокпия, фотодинамическая терапия, флуоресцентная и фосфоресцентная спектроскопия, синглетный кислород, триплетный хлорофилл

Направления исследований

• Изучение биохимии каспаз в процессах программируемой клеточной гибели (апоптоз, некроптоз, аутофагия)
• Изучение биохимии металлопротеиназ, регуляции их активности, поиск новых ингибиторов в процессах канцерогенеза, ангиогенеза и воспалительных процессах
• Изучение фотофизических и фотохимических свойств цветных флуоресцирующих белков из кораллов и применение их в методах субдифракционной микроскопии
• Разработка сенсоров активности каспаз и металлопротеиназ в живых клетках с использованием генетически кодируемых цветных белков и основанных на принципе индуктивно-резонанскного переноса энергии
• Разработка методов молекулярного имиджинга биохимических реакций на моделях мелких лабораторных животных. Разработка новых методов флуоресцентной томографии
• Изучение фотофизических свойств красителей в ближнем инфракрасном диапазоне и разработка методов их применения в фотодинамической терапии опухолей. Изучение механизмов и особенностей иммунного ответа при фотодинамическом воздействии на первичные солидные опухоли
• Исследование первичных механизмов фотодинамического стресса в растительных и животных клетках

Основные методы исследований
В рамках фундаментальных и прикладных исследований в лаборатории широко применяются методы флуоресцентной спектроскопии и микроскопии, клеточной биологии, in vivo молекулярного имиджинга мелких лабораторных животных, а также современные методы протеомики, выделения, очистки и идентификации различных биологических соединений, такие как масс-спектрометрия, двумерный электрофорез, высокоэффективная жидкостная хроматография.

В лаборатории используется комплекс наиболее современных методов флуоресцентной микроскопии для изучения живых клеток, среди них:

• один из наиболее высокоинформативных методов конфокальной флуоресцентной микроскопии с пикосекундным временным разрешением с двумя каналами регистрации и спектроанализатором;
• система для регистрации и спектроскопии одиночных молекул построеннная на принципе полного внутреннего отражения возбуждающего света;
• система корреляционной флуоресцентной спектроскопии и микроскопии с пикосекундным разрешением;
• система термостатирования с СО2 инкубатором для длительного прижизненного анализа клеток.

В лаборатории имеются специальные помещения и оборудование для проведения работ с культурой клеток и мелкими лабораторными SPF- животными (свободными от специфических патогенов), метаболические клетки для животных и оборудование для криогистохимических анализов.

Для проведения измерений наSPF- животных в лаборатории имеется наиболее полный набор приборов для проведения прижизненных флуоресцентных измерений:

• в режиме планарной конфигурации (съемка с поверхности) на различных длинах волн;
• томографических измерений в ближнем инфракрасном диапазоне (трехмерные изображения внутренних органов и биохимических реакций в них) на четырех фиксированных длинах волн;
• уникальная установка для конфокального лазерного сканирования макро объектов с использованием пикосекундного супер континуума с оптоакустическим фильтром в видимой и ближней инфракрасной области.

Для проведения протеомных исследований в лаборатории используется система двумерного электрофореза с двумя флуоресцирующими красителями и флуоресцентным гелевым сканером, оснащенным соответствующими фильтрами, что позволяет различать несколько тысяч белков. В сочетании с имеющимся в институте масс-спектрометром это позволяет надежно идентифицировать протеомный ответ в клетках при различных внешних воздействиях в процессе фотодинамической терапии.

Краткая история лаборатории
В 1991 году временный трудовой коллектив «Флуоресцентные иммуносенсоры» под руководством д.х.н. Савицкого А.П. был преобразован в лабораторию молекулярной иммунологии под его же руководством. В лаборатории выполнялся широкий круг работ по разработке нового поколения иммуносенсоров, включающий весь цикл их создания начиная от получения моноклональных антител, разработки принципиально новых флуоресцентных меток на основе лантанидов и фосфоресцирующих металлопорфиринов и заканчивая разработкой новых методов анализа социально значимых заболеваний, прежде всего ориентированных на использование в программе неонатального скрининга новорожденных в РФ. В лаборатории также велись работы по направленному транспорту фотосенсибилизаторов в опухоли с использованием моноклональных антител.

В 1998 году, после начала работ по новым цветным флуоресцирующим белкам, лаборатория была переименована в лабораторию физической биохимии. Новое название полно отражало весь спектр работ, ведущихся в лаборатории, в особенности работы по изучению физико-химических свойств прежде всего красных флуоресцирующих белков и разработки новых методов их использования при конструировании молекулярных сенсоров для in vivo энзимологии и новых методов субдифракционной микроскопии.

В 1999-2008 годах в лаборатории работал выдающийся биолог-эволюционист Юлий Александрович Лабас, автор идеи поиска новый флуоресцирующих белков в кораллах. Эта идея блестяще подтвердилась в совместных работах с лабораторией С.А.Лукьянова из института биоорганической химии им. академиков Шемякина и Овчинникова и положила основу новому направлению в создании широчайшего спектра целого ряда биотехнологических методов.

ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

Лаборатория занимается изучением физико-химических свойств цветных флуоресцирующих белков и созданием на их основе молекулярных сенсоров для изучения ферментативных реакций in vivo. Наибольшее внимание уделяется двум ферментативным каскадам – каспазному и металлопротеиназному, играющими важную регуляторную роль как в норме, так и в патологии, в частности при программируемой клеточной гибели и в процессах метастазирования и ангиогенезе.

Важным направлением в работе лаборатории является разработка новых маркеров для применения в методах современной субдифракционной микроскопии.

Не менее важным направлением является трансляция уже разработанных сенсоров для клеточной биологии на более сложные системы, в первую очередь на мелких лабораторных животных, экспериментальные модели на которых в настоящее время являются основой при разработке новых лекарств и оценки их системного действия.

С использованием принципиально новых экспериментальной базы и методических подходов в лаборатории ведутся работы по совершенствованию методов фотодинамической терапии опухолей, поиск новых сенсибилизаторов стимулирующих иммунный ответ при фотодинамическом воздействии.

Основные достижения лаборатории:

• Разработаны новые классы меток (фосфоресцентные и лантанидные) для иммуноанализа и других методов анализа по связыванию.
• Разработаны методы селективной фотодеструкции (стерилизации) грамположительных, грамотрицательных бактерий и дрожжей при использовании различных порфиринов.
• Изучена структура монослоев антител (пленки Лэнгмюра-Блоджет) в зависимости от плотности упаковки антител и поверхностного давления (распознающий элемент иммуносенсоров).
• Изучена роль микросекундной конформационной подвижности белковой глобулы в дискриминации субстратов пероксидаз по размеру.
• Совместно с Институтом биоорганической химии им. Академиков Шемякина и Овчинникова открыт новый класс флуоресцирующих цветных белков и хромопротеинов из кораллов, гомологичных GFP.
• Установлена природа фемтосекундной дезактивации возбужденного состояния белка KFP (мутант asFP595), при этом разгорание флуоресценции при изменении мощности светового облучения связано с последовательным поглощением двух фотонов, при этом первый фотон формирует новое конформационное состояние в белке, ответственное за интенсивную флуоресценцию белка.
• Методам молекулярного моделирования КМ/ММ установлена определяющая роль конформации белка asFP595 в формировании энергетически предпочтительного транс состояния хромофора в основном состоянии, по сравнению с другими белками и водными растворами. Расчеты возбужденного состояния хромофора в цис-конформации в белковом окружении подтверждают гипотезу транс-цис изомеризации при возгорании флуоресценции белка asFP595. Методами флуоресцентной спектроскопии подтверждено, что в хромопротеине asFP595 и его мутантах при щелочных значениях рН флуоресцирует цис форма хромофора, которая имеет характеристический максимум поглощения S0-S2 при 340 нм.
• Установлены причины аггрегации цветных белков из коралов и получены неаггрегирующиемутанты для всей группы белков.Открыт новый фотопереключаемый белок SAASOti и получены его мономерные формы. Белок имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционно используемым в субдифракционном методе PALM белком KAEDE.
  — Разработаны методы перевиваемости флуоресцирующих опухолей без потери ими антигенныхсвойств, что позволяет изучать методами молекулярного имиджинга прижизненное действиепротивоопухолевых препаратов.
• Были получены и охарактеризованы генетически кодируемыесубстраты каспазы 3: TR-23-К на основе мономерного белка TagRFP и тетрамера КFP и Tb3+-СП-TagRFP на основе тербийсвязывающего пептида и мономера TagRFP. Показана возможность эффективной трансфекции и экспрессии конструкции TR-23-К вопухолевых клеточных линиях. Лентивируснаятрансфекция выбрана как оптимальный способ трансфекции исходя из скорости получения трансдуктанта и эффективности его выхода. Получены 3 линии клеток человеческих опухолей эпидермальногопроисхождения, трансфецированныхTagRFP/KFP-сенсором. Была осуществлена регистрация протеолитической активности каспазы-3, ключевого ферментаапоптоза, в живых клетках с использованием FRET-FLIM технологии и конфокальной микроскопии. Анализ распределения временижизни в клетках позволил дискриминировать апоптотические клетки от живых клеток в пределаходной клеточной популяции.

В группе изучения активных форм кислорода:

• Обнаружение фосфоресценции триплетного хлорофилла и его аналогов сначала в растворах этих соединений, а затем в листьях растений, хлоропластах, их фрагментах и изолированных реакционных центрах фотосистемы 2. Использование этого эффекта для регистрации и изучения триплетных состояний хлорофилла и его предшественников в фотосинтетическом аппарате и модельных сисемах. Демонстрация того, что измерение фосфоресценции – эффективный метод анализа механизма и глубины фотоокислительного стресса в растениях.
• Обнаружение фосфоресценции ИК синглетного молекулярного кислорода в аэрированных растворах хлорофилла и других пигментов-фотосенсибилизаторов при комнатной температуре. Широкое применение этого явления для выяснения роли синглетного кислорода в связи с проблемами фотохимии, фотобиологии и фотомедицины.
• Создание уникальных лазерных спектрометров для кинетических измерений фосфоресценции синглетного кислорода в воде и суспензиях клеток. Наиболее точное измерение времени жизни синглетного кислорода в воде.
• Приоритет данной группы в обнаружении этих явлений полностью признан. Метод измерения фотосенсибилизированной фосфоресценции синглетного кислорода повсеместно и широко используется в экспериментальных исследованиях.

В лаборатории получены гранты РНФ, по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», РФФИ и др.

Сотрудники лаборатории ежегодно участвуют в различных отечественных и международных мероприятиях в качестве экспертов, докладчиков и слушателей.

В лаборатории постоянно ведется работа с молодежью и проводится работа по подготовке молодых специалистов. За время существования Лаборатории по тематике исследований были защищены 1 докторская и более 10 кандидатских диссертаций.

СОСТАВ ЛАБОРАТОРИИ

УНИКАЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

1.  A.V.Gavshina, N.K.Marynich, M.G.Khrenova, I.D.Solovyev, A.P.Savitsky.  The Role of Cysteine Residues in the Allosteric Modulation of the Chromophore Phototransformations of Biphotochromic Fluorescent Protein SAASoti. Scientific reports, DOI: 10.1038/s41598-021-03634-9 (2021). Q1
2. M Shleeva, A Savitsky, A Kaprelyants. Photoinactivation of mycobacteria to combat infection diseases: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology, 1-11, (2021) Q1
3. D.K Tuchina, I. G Meerovich, O. A Sindeeva, V.V Zherdeva, A. P Savitsky, A.A Bogdanov Jr, V. V Tuchin. Magnetic resonance contrast agents in optical clearing: Prospects for multimodal tissue imaging. Journal of Biophotonics, e201960249 (2020) Q1
4. Shleeva MO, Savitsky AP, Nikitushkin VD, Solovyev ID, Kazachkina NI, Perevarov V.V., Kaprelyants A.S. Photoinactivation of dormant Mycobacterium smegmatis due to its endogenous porphyrins. Applied microbiology and biotechnology, 1-9 (2019)
5. Solovyev ID, Gavshina AV, Savitsky AP. Novel Phototransformable Fluorescent Protein SAASoti with Unique Photochemical Properties. International journal of molecular sciences 20 (14), 3399 (2019)
6. Solovyev, I.D., Gavshina, A.V., Katti, A.S., Chizhik, A.I., Vinokurov, L.M., Lapshin, G.D., Ivashina, T.V., Khrenova, M.G., Kireev, I.I., Gregor, I., Enderlein, J., and Savitsky, A.P. Monomerization of the photoconvertible fluorescent protein SAASoti by rational mutagenesis of single amino acids, Scientific reports, 8 (1), 15542 (2018)
7. V.V. Zherdeva; N.I. Kazachkina; V.I. Shcheslavskiy; A.P. Savitsky. Long-term fluorescence lifetime imaging of a genetically encoded sensor for caspase-3 activity in mouse tumor xenografts. J. of Biomedical Optics, 23(3), 035002 (2018)
8. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. — Nat Biotechnol, 1999, Oct 17(10), p. 969-73
9. Lukyanov K.A., Fradkov A.F., Gurskaya N.G., Matz M.V., Labas Yu.A., Savitsky A.P., Markelov M.L., Zaraisky A.G., Zhao X., Fang Y., Tan W., Lukyanov S.A. Natural Animal coloration can be determined by a nonfluorescent green fluorescent protein homolog. — J.Biol.Chem., 2000, v. 275, N. 34, p. 25879-25882
10. Alexander P. Savitsky, Alexander L. Rusanov, Victoria V. Zherdeva, Tatiana V. Gorodnicheva, Maria G. Khrenova and Alexander V. Nemukhin. FLIM-FRET Imaging of Caspase-3 Activity in Live Cells Using Pair of Red Fluorescent Proteins. -Theranostics, 2012, v. 2, N 2, pp. 215-226. (DOI:10.7150/thno.3885)
11. B. Grigorenko, A. Savitsky, I. Topol, S. Burt, A.Nemukhin. Ground-State Structures and Vertical Excitations for the Kindling Fluorescent Protein asFP595. — J. Phys. Chem. B, 2006, v.110, p.18635-18640
12. I.V. Turchin, V.A. Kamensky, V.I. Plehanov, A.G. Orlova, M.S. Kleshnin, I.I. Fiks, M.V. Shirmanova, I.G. Meerovich, L.R. Arslanbaeva, V.V. Jerdeva, A.P. Savitsky. Fluorescence diffuse tomography for detection of red fluorescent protein expressed tumors in small animals. — Journal of Biomedical Optics, 2008, v.13, N 4
13. Tanja A. Schüttrigkeit, Till von Feilitzsch, Christian K. Kompa, Konstantin A. Lukyanov, Alexander P. Savitsky, Alexander A. Voityuk and Maria E. Michel-Beyerle. Femtosecond study of light-induced fluorescence increase of the dark chromoprotein asFP595. — Chemical Physics, 2006, v. 323, p. 149-160
14. Romanova N.A., Brovko L.Y., Moore L., Pometun E., Savitsky A.P., Ugarova N.N., Griffiths M.W. Assessment of Photodynamic Destruction of Escherichia coli O157:H7 and Listeria monocytogenes by Using ATP Bioluminescence. — Applied and Environmental Microbiology, 2003, v. 69, p. 6393–6398
15. Krasnovsky A. A. Luminescence and photochemical studies of singlet oxygen photonics. — J. Photochem. Photobiol.: A: Chem., 2008, v. 196, p. 210-218
16. Krasnovsky A. A. Сhlorophyll isolation, structure and function: major landmarks of the early history of research in the Russian Empire and the Soviet Union. — Photosyth. Res., 2003, v. 76, p. 389-403
17. Krasnovsky A.A., Roumbal Ya.V., Ivanov A.V., Ambartzumian R.V. Solvent depen¬den¬ce of the steady-state rate of 1O2 generation upon excitation of dissolved oxygen by cw 1267 nm laser radiation in air-saturated solutions. Estimates of the absorbance and molar absorption coefficients of oxygen at the excitation wavelength. — Chem. Phys. Lett., 2006, v. 430, p. 260-264

1. Тестирование противоопухолевых лекарственных средств нового поколения на клеточных и животных моделях
2. Тестирование новых нанокомпозитных материалов на биосовместимость in vitro и in vivo
3. Тестирование специфической активности и фотодинамической активности новых красителей и фотосенсибилизаторов
4. Изучение распределения различных флуорофоров и люминесцирующих соединений в организме мышей in vivo