Цель проекта: разработка нового поколения биологических средств защиты растений (СЗР) с использованием фермента- хитиназы GH19, обладающей фитопротекторными свойствами, с использованием цифровой платформы машинного обучения.

Ожидаемые результаты:

• Будет получена рекомбинантная хитиназы GH19 в растворимой форме в водной фазе в бактериальной системе E.coli, разработана система рефолдинга рекоминантного белка
• Будет осуществлен один цикл направленной эволюции хитиназы GH19 с использованием стратегии KnowVolution и проведен рациональный дизайн белковой глобулы хитиназы для улучшения растворимости
• Будет разработан алгоритм цифровой платформы машинного обучения для дальнейшей белковой инженерии хитиназы GH19

• Проведен анализ научно-технической и патентной литературы по теме использования различных биоинформатических методов для рационального дизайна карбогидраз. Описаны современные подходы к белковой инженерии ферментов, связанные с применением открытых интернет-ресурсов и методов молекулярной динамики. Приведено обоснование выбора хитиназы GH19 как объекта дальнейшего изучения.
• Проведены эксперименты по клонированию и экспрессии гена chi19 в бактериальной системе экспрессии E.coli. Показано, что даже при использовании наилучшей системы экспрессии в клетках E.coli Arctic Express, выход растворимого белка не превышает 5%. Поэтому, была разработана лабораторная методика рефолдинга нерастворимой хитиназы GH19.
• Проведено выделение гомогенной формы хитиназы GH19 и определены ее биохимические характеристики. Показано, что новая хитиназа имеет активность по коллоидному хитину (260 Ед/г), а активность по кристаллическому хитину и хитозану примерно одинаковая (65 Ед/г). pH-оптимум фермента составляет 4.5, Т-оптимум находится при 55оС.
• Анализ аминокислотной последовательности хитиназы GH19 и молекулярное моделирование фермента показало наличие 17 цистеинов, 6 из которых находятся на поверхности белковой глобулы и экспонированы в раствор, что потенциально может приводить к образованию межглобулярных дисульфидных связей и выпадению белка в нерастворимой форме. Проведен мутагенез выбранных остатков (С210А, С250S и С305Т) и показано, что одновременное замещение всех 3-х цистеинов приводит к образованию растворимой формы белка.
• Проведена оценка фитопротекторных свойств мутантной и нативной форм хитиназы GH19. Показана фунгицидная активность полноразмерной хитиназы GH19 против Parastagonospora nodorum – основного фитопатогена пшеницы, что делает новую хитиназу GH19 потенциальным кандидатом для использования в сельском хозяйстве в качестве БСЗР- биологического средства защиты растений.

Цель настоящего проекта состоит в модернизации и масштабировании в  условиях реального промышленного производства технологии получения кормового белка на основе метанотрофных микроорганизмов (Гаприн) за счет использования новых высокоэффективных штаммов-продуцентов и контроля их геномно-метаболических характеристик, а также повышения эффективности процесса культивирования путем  разработки и применения верифицированной модели контроля массопереноса в системе газ-жидкость.

• Сформирован научный и технологический  задел для разработки новой, эффективной, конкурентоспособной технологии кормового белка  на основе метанотрофов.
• Проведен анализ современной научной и патентной литературы, подтвердивший перспективность и оригинальность  выбранных направлений исследований.
• Подготовлены аналитический обзор и отчет о патентных исследованиях.
• Впервые проведена расшифровка генетического потенциала основного я штамма-продуцента на основе анализа  геномной последовательности, что открывает возможности  редактирования его метаболизма.
• Впервые получены экспериментальные данные в пользу выдвинутой нами гипотезы о нестабильности роста метанотрофа-продуцента за счет  лизиса фагами и потребности в редкоземельных элементах.
• Разработана  техническая документация  на стендовое оборудование для непрерывного культивирования метанотрофов и автоматизированную систему  управления технологическим процессом (АСУТП),

• Выполнены монтаж и запуск «Стенд 01-2.5/10» и «Стенд 02-40» для отработки технологии получения
  белка, а также «Стенд 03-0.9 для моделирования массообмена в биореакторах.
• Проведены экспериментальные исследования, включая контроль наличия фагов, мониторинг и оптимизацию состава ассоциации «Штамм Concept-8» и бактерий-спутников, получение блок- мутантов по генам биосинтеза гликогена и сахарозы и оценку питательных свойств альтернативного продуцента «Штамм Concept-20», создание коллекции новых штаммов-продуцентов.
• Проведена оптимизация условий культивирования «Штамм Concept-8» и получен препарат микробного белка, соответствующий требованиям к кормовым добавкам. Разработана и верифицирована математическая модель массопереноса и определены технические требования к проектированию струйных ферментеров с оптимальными массообменными характеристиками.

Целью работы является поиск продуцентов новых метаболитов (органических кислот и экстремолитов) для биотехнологии. Термофильные микроорганизмы, обитающие в природных термальных местообитаниях — наземных и морских горячих источниках, вулканических почвах, высокотемпературной подземной биосфере — характеризуются высокими температурами роста и особой стабильностью биополимеров, в том числе ферментов и низкомолекулярных метаболитов, что делает их привлекательными с точки зрения использования в различных областях биотехнологии.

На 1-м этапе проекта выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках проекта; проведены патентные исследования; проведен скрининг коллекции термофильных микроорганизмов на способность к образованию экстремолитов; разработана лабораторная методика идентификации генов экстремолитов; проведен скрининг коллекции термофильных микроорганизмов на способность к продукции органических кислот, используемых для подкисления кормов сельскохозяйственных животных; выполнена оценка способности термофильных микроорганизмов-гидролитиков к образованию олиго- и моносахаров с пребиотическими свойствами из комплексного органического сырья.

Иностранным партнёром выполнена разработка методов генетической инженерии для массового клонирования генов биосинтеза экстремолитов в промышленно значимые штаммы-продуценты, проведено тестирование методов генетической инженерии для массового клонирования генов биосинтеза экстремолитов.

На 2-м этапе выполнения проекта были получены следующие результаты:

• Выявлены целевые гены путей биосинтеза экстремолитов и органических кислот, а также неполного гидролиза полисахаридов у термофильных штаммов-продуцентов;
• Созданы оптимальные генные конструкты для штаммов-продуцентов в сотрудничестве с иностранными научными партнерами;
• Произведён отбор штаммов, активно образующих ацетат, лактат или другие органические кислоты, а также олиго- и моносахара из биополимеров растений, перспективных для дальнейшего коммерческого использования при создании новых сельскохозяйственных пре- и пробиотиков;
• Выявлены оптимальные параметры образования целевых продуктов выделенными штаммами-продуцентами;
• Разработаны методические рекомендации по практическому применению выявленных штаммов-продуцентов в сельском хозяйстве и косметической промышленности;
• Разработан протокол о применении отобранных штаммов или их генов на практике. Выявлены наиболее эффективные штаммы-продуценты олиго- или моносахаров для внедрения в производство;
• Проведены дополнительные патентные исследования.
• Созданы оптимальные генные конструкты для промышленно значимых штаммов-продуцентов экстремолитов;
• Выполнено клонирование генов биосинтеза экстремолитов, обнаруженных российскими партнёрами, с использованием созданных генных конструктов.

Разработать маcштабируемую технологию получения рекомбинантных белков – фосфолипазы А2 и химозина, предназначенных для эффективной переработки сельскохозяйственной продукции.

На первом этапе были выполнены следующие работы:

• Выполнен обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы в области научно-технической проблемы, исследуемой в рамках ПНИЭР.
•  Проведены патентные исследования.
• Оптимизированы параметры гена ЦП1 в составе вектора. Разработан протокол получения оптимизированного вектора с геном рекомбинантного белка фосфолипаза А2 (целевой продукт 1, ЦП1).
• Наработан вектор, несущий ген ЦП1.
• Разработан протокола получения штамма-продуцента, модифицированного вектором, несущим ген ЦП1.
• Оптимизированы условия культивирования штамма-продуцента и экспрессии ЦП1.
• Разработаны технические требования к экспериментальным образцам ЦП1.
• Разработаны методики оценки качества ЦП1.
• Разработан протокол выделения и очистки ЦП1.
• Разработаны ПМИ испытаний экспериментальных образцов ЦП1.
• Разработан лабораторный регламент получения ЦП1.
• Наработаны экспериментальные образцы ЦП1 в соответствии с разработанным лабораторным регламентом.
• Проведены испытания экспериментальных образцов ЦП1 на соответствие требованиям ТЗ и техническим требованиям.
• Выполнена оценка воспроизводимости лабораторного регламента получения ЦП1.

Индустриальным партнером проведены следующие работы:

• Выполнено материально – техническое обеспечение работ.
• Произведена апробация разработанного лабораторного регламента получения ЦП1 на базе ИП.
• Наработана экспериментальная партия пищевой продукции, полученной с использованием экспериментальных образцов ЦП1, оценено качество экспериментальной партии пищевой продукции.
• Выполнен комплекс работ по материально-техническому обеспечению опытного производства ЦП1 и ЦП2 (начало выполнения работ).

На втором этапе были выполнены следующие работы:

• оптимизированы параметры гена ЦП2 в составе вектора;
• наработан вектор, несущий ген ЦП2;
• разработан протокол получения оптимизированного вектора с геном рекомбинантного белка химозин (целевой продукт 2, ЦП2);
• оптимизированы условия культивирования штамма-продуцента и экспрессии ЦП2;
• разработан протокол получения штамма-продуцента, модифицированного вектором, несущим ген ЦП2;
• разработаны технические требования к экспериментальным образцам ЦП2;
• разработан протокол выделения и очистки ЦП2;
• разработаны методики оценки качества ЦП2;
• разработаны ПМИ испытаний экспериментальных образцов ЦП2;
• разработан лабораторный регламента получения ЦП2;
• наработаны экспериментальные образцы ЦП2 в соответствии с разработанным лабораторным регламентом;
• проведены испытания экспериментальных образцов ЦП2 на соответствие требованиям ТЗ и техническим требованиям;
• выполнена корректировка лабораторного регламента по итогам испытания экспериментальных образцов ЦП2 (при необходимости);
• разработаны условия хранения ЦП1;
• оценена воспроизводимость лабораторного регламента получения ЦП2.

Индустриальным партнером проведены следующие работы:

• проведено материально – техническое обеспечение работ.
• осуществлена апробация разработанного лабораторного регламента получения ЦП2 на базе ИП.
• проведена наработка экспериментальной партии пищевой продукции, полученной с использованием экспериментальных образцов ЦП2, оценка качества экспериментальной партии пищевой продукции.
• проведен комплекс работ по материально-техническому обеспечению опытного производства ЦП1 и ЦП2 (продолжение выполнения работ).

На третьем этапе были выполнены следующие работы:

• разработаны технические требования к опытным образцам ЦП1;
• разработан опытно-промышленный регламент получения ЦП1;
• разработаны и валидированы методики оценки качества опытных образцов ЦП1;
• разработана ПМИ испытаний опытных образцов ЦП1;
• наработаны опытные образцы ЦП1;
• проведены испытания опытных образцов ЦП1 в соответствии с ПМИ;
• разработаны технические требования к опытным образцам ЦП2;
• разработан опытно-промышленный регламент получения ЦП2;
• разработаны и валидированы методики оценки качества ЦП2;
• разработана ПМИ испытаний опытных образцов ЦП2;
• наработаны опытные образцы ЦП2;
• проведены испытания опытных образцов ЦП2 в соответствии с ПМИ;
• проведена технико-экономическая оценка результатов ПНИЭР;
• проведены дополнительные патентные исследования;
• обобщена и составлена оценка полученных результатов;
• разработаны технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей, и особенностей индустриального партнера;
• разработаны условия хранения ЦП2.

Индустриальным партнером проведены следующие работы:

• выполнено материально – техническое обеспечение работ;
• осуществлен комплекс работ по материально-техническому обеспечению опытного производства ЦП1 и ЦП2 (завершение выполнения работ).
• запущены опытные линии производства ЦП1 и ЦП2;
• апробирован разработанный ОПР получения ЦП1 на базе ИП, наработаны опытные образцы ЦП1;
• апробирован разработанный ОПР получения ЦП2 на базе ИП, наработаны опытные образцы ЦП2;
• оценено качество опытных образцов ЦП1, наработанных на базе ИП;
• оценено качество опытных образцов ЦП2, наработанных на базе ИП;
• наработана и проведена оценка качества экспериментальной партии пищевой продукции, полученной с использованием опытных образцов ЦП1;
• наработана и проведена оценка качества экспериментальной партии пищевой продукции, полученной с использованием опытных образцов ЦП2

На 4-м (заключительном) этапе выполнения работ по проекту выполнялись работы по подготовке итогового резюме по проекту, аналитической справке о выполнении проекта, отчета о расходах, а также отчета о достижении значений показателей результативности использования гранта в форме субсидии.

Проект направлен на создание комплексной ресурсосберегающей биотехнологии переработки коммунальных органических отходов в биогаз и удобрения с применением передовых методов (электрофизического воздействия, процесса частичной нитрификации-анаммокс и экономной аэрации), на примере оптимизации процессов переработки осадков сточных вод коммунальных очистных сооружений и может быть использована также для переработки отходов сельского хозяйства, пищевой и перерабатывающей промышленности. Результаты настоящего проекта найдут широкое применение в коммунальном хозяйстве (очистные сооружения, предприятия  по утилизации органических отходов), а также на предприятиях пищевой и перерабатывающей отраслей. Применение разрабатываемой технологии обеспечит:

• получение значимых научных результатов, позволяющих переходить к созданию новых видов научно-технической продукции и продуктов с высокой добавленной стоимостью;
• создание технологического задела для широкомасштабного применения в России комплексной высокоскоростной ресурсосберегающей экобиотехнологии переработки органических отходов в установках нового поколения, позволяющих получить целевые продукты (биогаз, биоудобрение) с повышенной энергетической и агрономической ценностью.

Применение разрабатываемой технологии обеспечит замещение импорта и обеспечение экспортного потенциала:

импортозамещение продукции компаний Waasa (Вааза, Финляндия), Biotechnische Abfallverwertung GmbH & Co. KG (BTA) (Мюнхен, Германия) и Linde-KCA (Дрезден, Германия) — реакторов и систем анаэробной ферментации жидких и полужидких отходов; компаний Apromera (East Ham, Лондон, Великобритания), AGRO-EKO S.R.O. (Albrechtice, Чехия) – систем аэробной ферментации твердых органических отходов; компаний Paques, Waterstromen (Нидерланды), Kurita (Япония) – системы микробиологической очистки жидкой фракции сброженной массы от азота.

Практическое внедрение результатов проекта также будет способствовать  постепенному развитию и внедрению переработки ОСВ и органической фракции ТБО в закрытых высокоскоростных анаэробных реакторах нового поколения с получением энергии, что позволит сокращать площади, отчуждаемые для организации полигонов ТБО.

На этапе 1 в период с 26 сентября 2017 г. по 31 декабря 2017 г. выполнены следующие основные работы:

• Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ.
• Проведены патентные исследования.
• Разработаны лабораторные методики анализа ключевых групп микроорганизмов, трансформирующих органических загрязнения.
• Разработана технологическая схема процесса высокоскоростной анаэробной переработки гомогенизированных текучих (до 89% влажности) органических отходов в анаэробных реакторах нового поколения, в которых скорость метаногенеза значительно ускоряется путем электрофизического воздействия.
• Технологические и экономические преимущества разрабатываемых анаэробных реакторов представляются существенными и заключаются в относительной простоте конструкции реактора, увеличенной скорости конверсии органических отходов в биогаз с повышенным содержанием метана, низком электропотреблении электростимулирующего устройства, а также в существенном снижении капитальных затрат на изготовление реактора и эксплуатационных затрат на единицу производимой продукции. Применение передовых методов (электрофизического воздействия, процесса частичной нитрификации-анаммокс и экономной аэрации) в реализуемом проекте соответствуют мировому уровню, что подтверждается результатом анализа мировой литературы и патентного поиска.
• Полученные научные и научно-технические результаты соответствуют требованиям Технического задания Соглашения №14.604.21.0190 от «26» сентября 2017 г.
• На средства индустриального партнера, АО «Компания «ЭКОС», проведены предусмотренные проектом работы:
• Отчет о проведенном анализе объемов и состава производимых органических отходов и используемых в РФ способов их переработки и утилизации, включая статистические и санитарно-биологические данные.
• Технические требования и эскизная конструкторская документация на изготовление испытательного (лабораторного) стенда: реактор частичной нитрификации и анаэробного окисления аммония (АНАММОКС) для очистки иловой воды от азота.

Результаты ПНИ позволяют перейти к созданию лабораторных стендов и проведению экспериментальных исследований.

На втором этапе проекта выполнены следующие виды работ:

• Разработаны Технические требования и эскизная конструкторская документация к испытательному (лабораторному) стенду: высокоскоростному анаэробному биогазовому реактору с устройством электрофизического воздействия на метаногенное сообщество микроорганизмов.
• Изготовлен испытательный (лабораторный) стенд: высокоскоростной анаэробный биогазовый реактор с устройством электрофизического воздействия на метаногенное сообщество микроорганизмов.
• Разработана Программа и методика экспериментальных исследований процесса переработки текучих органических отходов на испытательных (лабораторных) стендах: высокоскоростном анаэробном биогазовом реакторе с устройством электрофизического воздействия на метаногенное сообщество микроорганизмов и реакторе частичной нитрификации и анаэробного окисления аммония (АНАММОКС) для очистки иловой воды от азота.
• Проведены экспериментальные исследования процесса переработки текучих органических отходов на испытательных (лабораторных) стендах: высокоскоростном анаэробном биогазовом реакторе с устройством электрофизического воздействия на метаногенное сообщество микроорганизмов и реакторе частичной нитрификации и анаэробного окисления аммония (АНАММОКС) для очистки иловой воды от азота.
• Разработаны технические требования и эскизная конструкторская документация экспериментального образца установки компостирования с оптимизированной аэрацией.
• Изготовлен экспериментальный образец установки компостирования с оптимизированной аэрацией
• Изготовлен испытательный (лабораторный) стенд: реактора частичной нитрификации и анаэробного окисления аммония (АНАММОКС) для очистки иловой воды от азота.
• Разработана Программа и методики исследовательских испытаний экспериментального образца установки компостирования с оптимизированной аэрацией.
• Разработана Программа и методики исследовательских испытаний процесса очистки иловой воды от азота с помощью испытательного (лабораторного) стенда: реактора частичной нитрификации и анаэробного окисления аммония (АНАММОКС) для очистки иловой воды от азота.
• Проведены исследовательские испытания экспериментального образца установки компостирования с оптимизированной аэрацией.
• Проведены исследовательские испытания процесса очистки иловой воды от азота с помощью испытательного (лабораторного) стенда: реактора частичной нитрификации и анаэробного окисления аммония (АНАММОКС) для очистки иловой воды от азота.
• Разработана Программа и методики опробования экспериментального образца установки компостирования с оптимизированной аэрацией в пусковой период.

• Проведена обработка, обобщение и интерпретация результатов экспериментальных исследований. Подача постоянного электрического тока в реактор способствует увеличению выхода метана на 17% и снижению концентрации ЛЖК на 60%. Затраты энергии на питание электродов составляют 1,2-7,4% от энергии, заключенной в избыточно произведенном метане.
• Проведена разработка математической модели анаэробного разложения органического вещества текучих отходов при электрофизическом воздействии. Измененная математическая модель ADM1 адекватно описывает протекающий процесс анаэробной ферментации с дополнительным электрофизическим воздействием на микробное сообщество. Наибольший эффект наблюдалось при подаче на электроды постоянного тока 500 мА, а также при токе 200 мА и непрерывном гидравлическом перемешивании в системе.
• Разработан Лабораторный регламент.
• Разработан Перечень групп микроорганизмов микробных сообществ и процессов, ими осуществляющих. При электростимулировании повышается содержание микроорганизмов рода Anaerobaculum, которые являются синтрофами, за счет чего происходит увеличение выхода метана и стабилизирование реактора.
• Разработан Перечень основных факторов среды и их оптимальных значений.
• Проведена оценка эффективности полученных результатов экспериментальных исследований. При сопоставимом увеличении выхода метана путем стимуляции метаногенного сообщества микроорганизмов электрическим током достигнута почти на порядок более высокая скорость метанобразования (3 м3 СН4/(м3 сутки)).
• Разработаны предложения и рекомендации по реализации (коммерциализации) и вовлечению в хозяйственный оборот комплексной ресурсосберегающей биотехнологии.
• Разработан проект технического задания на проведение ОКР по теме: «Разработка экспериментальных установок полного цикла комплексной переработки коммунальных органических отходов в биогаз и биоудобрения».

Индустриальным партнером:

• Разработаны технико-экономическое обоснование для определения экономической эффективности внедрения экобиотехнологии для получения биогаза и биоудобрений с повышенной энергетической и агрономической ценностью.
• Проведены маркетинговые исследования состояния развития в России и за рубежом комплексных технологий получения биогаза и биоудобрений из органических отходов.

На 4-м (заключительном) этапе выполнения работ по проекту выполнялись работы по регистрации ранее полученных патентов в ФИПС, заключению лицензионных договоров, оформлению информационных карт (ИКСПО, ИКСИ), а также работы по подготовке итогового резюме по проекту, аналитической справке о выполнении проекта, отчета о расходах, отчета о достижении значений показателей результативности использования гранта в форме субсидии. Выполнение работ за счет финансирования из бюджетных и внебюджетных средств на 4 этапе проекта не предусмотрено.

Проект направлен на:

• создание технологии лабораторного уровня, позволяющей получать экспериментальные образцы полифенолов из стильбенов (ресвератрол и пиносильвин) и дигидрофлавонолов (дигидромерицетин) из коры и древисины хвойных пород;
• сопоставление антиоксидантной и про(анти)апоптотической активности экспериментальных образцов ресвератрола, пиносильвина и дигидромерицетина в отношении препаратов митохондрий in vitro и терапевтической эффективности в отношении животных моделей рассеянного склероза, печеночной энцефалопатии и трофической язвы при экспериментальном диабете у крыс;
• разработка готовых пероральных лекарственных форм ресвератрола, пиносильвина и дигидромерицетина, проведение испытаний их острой и субхронической токсичности.

• Составлен аналитический обзор по теме исследования.
• Выполнен патентный поиск. В ходе составления отчета было проанализировано более 165 источиков.
• Проведен сбор образцов древесины и коры хвойных пород (сосны обыкновенной (Pinus sylvestris), сосны кедровой (Pinus sibirica), ели обыкновенной (Picea abies), лиственницы сибирской (Larix sibirica), можжевельника обыкновенного (Juniperus communis)), доступных на территории РФ, из 7 регионов (Воронежской, Тамбовской, Липецкой, Владимирской и Вологодской областей, Пермского края и Республики Крым.
• Создана библиотека экстрактов полифенольных фракций полученных биоматериалов. Общее количество образцов, собранных в 7 регионах РФ, составило 38, из них 19 — образцов коры и 19 — образцов древесины. Максимальное ОПФ получено в образцах сосны обыкновенной из северных регионов РФ – 1 Пермского края и Вологодской области. Максимальное ССА отмечено для образцов ели обыкновенной из северных регионов РФ – Пермского края и Вологодской области.
• Разработаны методы гомогенизации и экстракции полученных полифенольных фракций древесины и коры хвойных пород по технологии, передаваемой европейским партнером. На основании разработанных технологических подходов разработаны Лабораторный технологический регламент получения Ресвератрола, Лабораторный технологический регламент получения Пиносильвина., Лабораторный технологический регламент получения Дигидромирицетина.

• Составлен литературный обзор по теме исследования.
• Выполнен патентный поиск. В ходе составления отчета было проанализировано более 170 источиков.
• Проведена наработка экспериментальных образцов ресвератрола, дигидромерицетина и пиносильвина, выделенных из собранных образцов древесины и коры хвойных пород (сосны обыкновенной (Pinus sylvestris), сосны кедровой (Pinus sibirica), ели обыкновенной (Picea abies), лиственницы сибирской (Larix sibirica), можжевельника обыкновенного (Juniperus communis)), доступных на территории РФ, из 2 регионов ( Вологодской области и Пермского края)
• Проведены исследовательские испытания антиоксидантной и проапоптотической активности наработанных экспериментальных образцов.
• Проведены исследовательские испытания терапевтической эффективности экспериментальных образцов с использованием моделей печеночной энцефалопатии, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и трофической язвы in vivo.
• Разработаны методы получения и очистки имидазольных производных полифенолов и стильбенов, полученных из древесины и коры хвойных пород по технологии, передаваемой европейским партнером.

На 3-м этапе были выполнены следующие работы:

• Разработана Программа и методика исследовательских испытаний антибактериальной, антифунгальной, антиоксидантной и про(анти)апоптотической активности in vitro на модели митохондрий из дрожжей Yarrowia lipolytica, Dipodascus magnusii и гепатоцитов крыс экспериментальных образцов имидазольных производных полифенолов и стильбенов из экстрактов фракций полифенолов биоматериалов их хвойных пород, доступных на территории РФ;
• Разработана Программа и методика исследовательских испытаний лекарственных форм пролонгированного действия на основе экспериментальных образцов ресвератрола, пиносильвина и дигидромерицетина, а также их имидазольных производных;
• Разработан проект фармакопейной статьи на готовую лекарственную форму ресвератрола и его имидазольных производных пролонгированного действия на основе гидрофильного носителя (гуаровая камедь);
• Разработан проект фармакопейной статьи на готовую лекарственную форму пиносильвина и его имидазольных производных пролонгированного действия на основе гидрофильного носителя (гуаровая камедь);
• Разработан проект фармакопейной статьи на готовую лекарственную форму дигидромерицетина и его имидазольных производных пролонгированного действия на основе гидрофильного носителя (гуаровая камедь);
• Разработана Программа и методика испытаний острой и субхронической токсичности препаратов полифенолов и стильбенов;
• Проведены исследовательские испытания острой и субхронической токсичности готовых лекарственных форм полифенолов и стильбенов пролонгированного действия на основе гидрофильного носителя (гуаровая камедь);
• Проведены исследовательские испытания антибактериальной, антифунгальной, антиоксидантной и про(анти)апоптотической активности in vitro на модели митохондрий из дрожжей Yarrowia lipolytica, Dipodascus magnusii и гепатоцитов крыс экспериментальных образцов не охарактеризованных препаратов полифенолов и стильбенов из экстрактов фракций полифенолов биоматериалов их хвойных пород, доступных на территории РФ;
• Проведены исследовательские испытания антибактериальной, антифунгальной, антиоксидантной и про(анти)апоптотической активности in vitro на модели митохондрий из дрожжей Yarrowia lipolytica, Dipodascus magnusii и гепатоцитов крыс экспериментальных образцов имидазольных производных полифенолов и стильбенов из экстрактов фракций полифенолов биоматериалов их хвойных пород, доступных на территории РФ;
• Проведена технико-экономическая оценка результатов ПНИЭР.

Работы иностранных партнеров, за счет внебюджетных средств:

• Осуществлено развертывание линии по изготовлению новых препаратов классов полифенолов и стильбенов из экстрактов фракций полифенолов биоматериалов их хвойных пород и их имидазольных производных (выполнено компанией ТрансМИТ ГмбХ);
• Разработана обобщенная  концепция  зависимости антиоксидантной, про(анти)апоптотической и специфической терапевтической активности полифенолов и стильбенов от их структуры (выполнено Фондом Эдмунда Маха).

На четвертом (заключительном) этапе проведения работ по проекту была подготовлена отчетная документация, а также были подведены итоги и обобщены результаты по проекту в целом:

В результате реализации проекта в целом была создана лабораторная технология, позволяющая получать экспериментальные образцы полифенолов из стильбенов (ресвератрол и пиносильвин) и дигидрофлавонолов (дигидромерицетин) из коры и древесины хвойных пород. Сопоставление антиоксидантной и про(анти)апоптотической активности экспериментальных образцов ресвератрола, пиносильвина и дигидромерицетина в отношении препаратов митохондрий in vitro и терапевтической эффективности в отношении животных моделей рассеянного склероза, печеночной энцефалопатии и трофической язвы при экспериментальном диабете у крыс, показало эффекты увеличивающие генерацию активных форм кислорода в 2,1 и 2,2 раза, соответственно, в случае дрожжей E. magnusii и в 2,3 и 1,64 раза, соответственно, в случае дрожжей Y.lipolytica; положительного действия полифенолов на динамике биохимических показателей крови экспериментальных животных, благоприятное воздействие на структурные свойства внутренних органов животных (структуру органа, морфологию клеток и функциональность тканей (отсутствие жировой и соединительнотканной гипертрофии, гематом, воспалительных очагов, отечности)). В исследованиях на изолированных смешанных культурах лейкоцитов из крыс линии DA (Dark Agouti) с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом при воздействии испытуемых экспериментальных образцов ресвератрола, пиносильвина и дигидромерицетина, выделенных из отечественного древесного сырья, в физиологических концентрациях достигалось снижение уровня продукции супе роке ид анион радикала под действием антигена (миелин) в концентрации 1 мкг/мл в 2 раза.

По результатам исследования субхронической токсичности было установлено, что прототипы готовых лекарственных форм пролонгированного действия на основе экспериментальных образцов полифенолов при его ежедневном 14-дневном внутрижелудочном введении крысам в однократной и десятикратной суточных терапевтических дозах не оказывают токсического действия, не вызывают гибели экспериментальных животных, нарушений индивидуального поведения, задержки прироста их массы тела, патологии гематологических и биохимических показателей крови, возникновения патологий внутренних органов, а также не обладают местнораздражающим действием в месте введения.

В результате проведенного доклинического изучения острой токсичности было выявлено, что прототипы готовых лекарственных форм пролонгированного действия на основе экспериментальных образцов полифенолов, вводимые однократно внутрижелудочно мышам в дозах вплоть до 5000 мг/кг, не оказывают токсического действия на организм животных, не вызывают гибели животных в течение 14 суток наблюдения после введения препарата, что позволяет отнести их к четвертому классу опасности — малоопасные вещества.

Формирование научно-технических основ для внедрения в практику методов, обеспечивающих получение массива данных об изменении концентраций в крови пациента антибиотиков и воспалительных маркеров в ходе антибиотикотерапии и вывода на основании этого массива данных о чувствительности либо устойчивости к антибиотикам бактерий – возбудителей заболевания. Разработка и апробация новой высокочувствительной высокопроизводительной иммунохроматографической тест-системы для быстрой оценки эффективности антибиотикотерапии, основанной на изменении оптических свойств наноразмерных маркеров.

Основные результаты, полученные на 1 этапе выполнения проекта (июль — декабрь 2017 года):

• Проведен анализ литературных источников по теме исследований.
• Проведены патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96, подтверждающие актуальность и новизну тематики проекта.
• Проведен выбор целевых антигенов и их контролируемых уровней (воспалительных маркеров: С-реактивный белок и прокальцитонин; антибиотиков: тетрациклины, пенициллины), количественные показатели которых характеризуют эффективность антибиотикотерапии.
• Сформирована панель иммунореагентов, необходимых для реализации тест-системы для оценки эффективности антибиотикотерапии, включая специфические антитела, биорецепторные молекулы, конъюгаты гаптенов с белками-носителями.
• Проведен анализ кандидатных антител и альтернативных биорецепторных молекул, включая их аффинность и специфичность, определенные в микропланшетном формате.
• Проведена характеристика методами просвечивающей электронной микроскопии и регистрации динамического светорассеяния по размерам, форме, гетерогенности препаратов колориметрических нанодисперсных маркеров (коллоидного золота, латексных частиц), используемых в качестве меток в разрабатываемой тест-системе.
• Проведена экспериментальная характеристика возможностей снижения предела детекции обнаружения в иммунохроматографическом анализе при использовании новых видов маркеров и систем амплификации сигнала.
• Проведена характеристика антиген-связывающих свойств комплексов наноразмерных маркеров и биорецепторов к определяемым соединениям разного состава, полученных для различных соотношений компонентов в парах (антитело или биорецептор) – маркер.

За счет внебюджетных средств подготовлено программное обеспечение, позволяющего проводить количественную оценку результатов анализа с использованием разрабатываемой тест-системы с оптической детекцией сигнала (расчет концентрации контролируемых антигенов на основании регистрируемого оптического сигнала и предварительно полученной градуировочной зависимости).

Иностранным партнером получены наноструктурные материалы с различными оптическими свойствами и отобраны препараты для получения биорецепторных материалов. Проведен выбор оптимальных методов получения наноструктурных материалов, характеристика их физических свойств, в т.ч. сорбционной емкости. Проведена функционализация разработанных миниатюрных электродов для тест-систем. Проведена разработка приборного обеспечения для детектирования электрохимического сигнала тест-системы.

• Проведена экспериментальная характеристика концентрационных и кинетических закономерностей формирования детектируемых комплексов определяемых соединений и меченых биорецепторов в разрабатываемой иммунохроматографической тест-системе для оценки эффективности антибиотикотерапии (ТСОЭАТ).
• Изучены взаимодействия в ТСОЭАТ, реализуемые с использованием выбранных нанодисперсных маркеров, биорецепторных молекул и систем амплификации сигнала.
• Проведены сравнения различных форматов иммунохроматографического анализа, вариантов комплектации ТСОЭАТ, отличающихся расположением аналитических и контрольных зон.
• Для оценки патентоспособности разработанных решений проведены дополнительных патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96; подана заявка на патент (полезную модель).
• Выбраны условия проведения мультипараметрического определения антибиотиков и воспалительных маркеров в биологических жидкостях с помощью разрабатываемой ТСОЭАТ с целью оценки эффективности антибиотикотерапии.
• Изучена специфичность ТСОЭАТ на основании перекрестной реактивности по отношению к антибиотикам из других групп и воспалительным маркерам.
• Получены градуировочные зависимости определения содержания контролируемых аналитов; проведена адаптация методов аппроксимации этих зависимостей для получения достоверных количественных данных по оценке эффективности антибиотикотерапии.

За счет внебюджетных средств проведена адаптация методики измерений эффективности антибиотикотерапии с использованием ТСОЭАТ и нового программного обеспечения, включая выбор варианта конструкции подложки для размещения ТСОЭАТ, обеспечивающей максимальную воспроизводимость результатов измерений.

Иностранным партнером проведена характеристика оптических и электрохимических свойств миниатюрных электродов, включая временные зависимости отклика на формирующиеся на их поверхности иммунные комплексы. Изучены зависимости между оптическим и/или амперометрическим сигналом тест-системы и концентрациями определяемых антибиотиков. Проведена апробация электрохимической тест-системы с использованием панели биопроб. Проведена разработка и характеристика программного обеспечения, позволяющего проводить количественную оценку результатов анализа с использованием разрабатываемой тест-системы с электрохимической детекцией сигнала.

• Сформированы панели биопроб, используемых для экспериментальной проверки эффективности тест-системы для быстрой оценки эффективности антибиотикотерапии (ТСОЭАТ).
• Изготовлены и апробированы экспериментальные образцы ТСОЭАТ в соответствии с разработанной программой и методиками испытаний с использованием сформированной панели проб.
• Получены с помощью ТСОЭАТ и аппроксимированы градуировочные зависимости; проведена адаптация методов аппроксимации для получения достоверных количественных данных по оценке эффективности антибиотикотерапии.
• Для оценки эффективности разработанных методик проведены подтверждающие анализы содержания антибиотиков в тестируемых пробах с использованием хроматографических методов.
• Сопоставлена эффективность вариантов ТСОЭАТ, отличающихся способами детектирования, включая оценку пределов обнаружения, рабочих диапазонов и воспроизводимости результатов изменений.
• Проведена сравнительная характеристика конкурентоспособности разработанной ТСОЭАТ по отношению к существующим коммерческим аналогам, включая оценку аналитических характеристик, срока годности, трудоемкости применения, пригодности для использования в различных по оснащенности лабораториях, ожидаемой (ТСОЭАТ) и существующей (аналоги) стоимости.
• Продемонстрирована возможность изменения комплектации ТСОЭАТ для определения соединений, относящихся к другим химическим классам, включая включение в комплектацию ТСОЭАТ реагентов для детекции еще одного терапевтического препарата и одного биомаркера и определение пределов обнаружения, рабочих диапазонов и воспроизводимости результатов изменений для расширенной комплектации ТСОЭАТ.
• Проведена характеристика стабильности ТСОЭАТ, основанная на сравнении различных вариантов стабилизации иммобилизуемых реагентов и изучении динамики изменений аналитических характеристик ТСОЭАТ при различных режимах хранения.
• Проведены дополнительные патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96 для оценки патентоспособности разработанных решений.
• Подана заявка на патент. Разработаны инструкция по использованию экспериментальных образов ТСОЭАТ и лабораторный регламент изготовления ТСОЭАТ.

За счет внебюджетных средств проведена апробация разработанных методик измерения с использованием сформированной панели проб.

Иностранным партнером проведены разработка электрохимической тест-системы для мультипараметрического определения антибиотиков, изготовление ее экспериментального образца и подготовка инструкция по применению. Проведена оценка эффективности разработанных подходов для контроля различных классов контаминант. Апробированы разработанные методики с использованием сформированной панели проб. Проведены совместные испытания экспериментальных образцов разработанных аналитических систем, сопоставлены результаты, получаемые с использованием ТСОЭАТ и электрохимической тест-системы.

Проведена сдача-приемка исполненных обязательств Получателя по Соглашению о предоставлении гранта. Дополнительно к статьям, подготовленным и опубликованным на предыдущих этапах выполнения проекта, вышла обзорная работа исполнителей проекта, отражающая возможности практического применения полученных результатов. Berlina A.N., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Monitoring antibiotics and inflammatory markers in human blood: Impact in choice of antibiotic therapy and used methods. Biomedical and Pharmacology Journal 2020, v. 13, N 3, p. 1075-1093. Выполнение работ за счет финансирования из бюджетных и внебюджетных средств на 4 этапе проекта не предусмотрено.

Разработка и апробация тест-систем для экспрессной (не более 30 минут) иммунодетекции приоритетных фитопатогенов при контроле пораженности винограда: вируса короткоузлия винограда, вируса А винограда и вируса скручивания листьев винограда –. для эффективной защиты сельскохозяйственных культур, предотвращения эпифитотий и потерь урожайности.

• Подготовлен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной и методической литературы по теме исследований. Проведены патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96, подтверждающие новизну разработок по тематике проекта и возможность патентования их результатов.
• Проведена теоретическая оценка факторов, определяющих пределы обнаружения разрабатываемых иммунохроматографических тест-систем; определены форматы разрабатываемых тест-систем с учетом требований к кинетическим и равновесным параметрам взаимодействий между иммунореагентами. Определены основные реагенты для разработки набора из трех тест-полосок, предназначенных для индивидуального контроля фитопатогенов (вируса короткоузлия винограда, вируса А винограда или вируса скручивания листьев винограда), а также для тест-полоски для одновременного контроля трех фитопатогенов.
• Проведена экспериментальная характеристика взаимосвязей между структурными и функциональными параметрами используемых в тест-системах модифицированных антител. Получены и охарактеризованы конъюгаты наночастиц золота с антителами, используемыми в разрабатываемых тест-системах. Выбраны участки для сбора биопроб и проведения испытаний разрабатываемых тест-систем в полевых условиях.

Индустриальным партнером за счет внебюджетных средств проведена сравнительная характеристика иммунохроматографических мембран и маркеров, планируемых к использованию при изготовлении иммунохроматографических тест-систем для контроля вирусных патогенов винограда.

• Проведена экспериментальная характеристика и апробация разрабатываемых аналитических систем для контроля приоритетных вирусных патогенов винограда, оценка их функциональных характеристик и эффективности как средств тестирования.
• Изучены взаимодействия между реагентами, входящими в комплектацию тест-систем; варианты регистрации результатов тестирования. Определены пределы детекции и рабочие диапазоны определения фитопатогенов, специфичность и стабильность тест-систем для индивидуального контроля фитопатогенов (вируса короткоузлия винограда, вируса А винограда или вируса) и для одновременного контроля трех вышеуказанных фитопатогенов.
• Проведен сбор растительного материала винограда и формирование панели проб. Разработаны методики подтверждающей идентификации фитопатогенов методом ПЦР и проведено тестирование сформированной панели биопроб. На основании полученных данных осуществлена сравнительная оценка распространенности фитопатогенов. Экспериментально сопоставлены методики пробоподготовки тестируемого растительного материала и выбрана оптимальная методика.
• Проведены дополнительные патентные исследования. Подготовлены заявки на патенты РФ, зарегистрировано ноу-хау.
• Разработаны инструкции по применению тест-систем, методики выявления и методические рекомендации по проведению экспрессной диагностики фитопатогенов; лабораторные регламенты изготовления экспериментальных образцов тест-систем. Разработаны программы и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов тест-систем, на основе которых проведены исследовательские испытания тест-систем в лабораторных и внелабораторных (полевых условиях), показавшие их соответствие условиям соглашения и практическим требованиям.
• Проведен анализ полноты решения задач и достижения поставленной цели ПНИЭР. Подготовлены предложения и технические требования по использованию разработанных тест-систем. Подготовлен проект технического задания на проведение ОТР по теме: «Создание технологии производства тест-систем для экспрессной иммунодетекции патогенов винограда».

Индустриальным партнером за счет внебюджетных средств с учетом требований серийного производства проведена сравнительная характеристика режимов нанесения иммунореагентов на мембраны, процедур сборки мультимембранных композитов, эффективности различных способов снижения неспецифических взаимодействий и воспроизводимости аналитических характеристик разработанных тест-систем. Разработаны методики контроля качества тест-систем.

Дополнительная информация об участии в мероприятиях по представлению результатов проекта, представлена на следующих веб-страницах: https://www.fbras.ru/ konferentsiya-biotehnologiya- nauka-i-praktika-2.html, https://www.fbras.ru/forum- perspektivnyie-tehnologii-v- agropromyishlennom-komplekse.html, https://www.fbras.ru/ mezhdunarodnyiy-kongress-po- zashhite-rasteniy.html

Проведена сдача-приемка исполненных обязательств Получателя по Соглашению о предоставлении гранта. По поданной заявке № 2018146716 получен патент РФ на полезную модель: «Иммунохроматографическая тест-система для экспрессной внелабораторной диагностики заболевания винограда, вызываемого вирусом скручивания листьев» (патент № 192778). Выполнение работ за счет финансирования из бюджетных и внебюджетных средств на 3 этапе проекта не предусмотрено.

Разработка тест-систем, основанных на принципе иммунохроматографии, обеспечивающих возможность проведения одновременной серодиагностики не менее чем трех инфекций крупного рогатого скота (бруцеллез, туберкулез, лейкоз). Развитие научно-технического сотрудничества с РГП «Национальный центр биотехнологии» Республики Казахстан для обмена опытом и совместного внедрения результатов исследований в практику.

• Подготовлен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной и методической литературы по тематике проекта.
• Проведены патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96 с целью выявления существующих тенденций развития средств ветеринарной внелабораторной диагностики инфекционных заболеваний.
• Осуществлен библиометрический анализ существующих тенденций развития и приоритетных направлений исследований в области ветеринарной диагностики.
• Выполнена теоретическая характеристика иммунохимических взаимодействий в проточных иммуноаналитических системах с использованием численных и нечисленных математических моделей.
• На примере серодиагностики бруцеллеза получены экспериментальных зависимостей иммунохимических взаимодействий между аналитическими реагентами на мультимембранной тест-полоске в проточном режиме. По результатам проведенной теоретической характеристики иммунохроматографических систем серодиагностики 25 декабря 2017 г. прочитана открытая лекция, текст и иллюстративные материалы которой размещены на сайтах https://studfiles.net/preview/6810617/ ; http://www.myshared.ru/slide/1368999/.
• Синтезированы наночастицы золота разного диаметра – маркеры для разрабатываемых аналитических систем – и их конъюгаты с антителами.
• Проведена оценка состава и функциональной активности конъюгатов при разных протоколах их получения.
• Осуществлена экспериментальная характеристика мембранных носителей – структурных компонентов разрабатываемых аналитических систем внелабораторной серодиагностики приоритетных инфекций крупного рогатого скота, их взаимодействия с нанодисперсными маркерами различной структуры и компонентами проб (сывороток крови).
• Проведено сравнение различных режимов нанесения реагентов на иммунохроматографические мембраны. разработка требований к режимам иммобилизации иммунореагентов для серодиагностики на мембранные носители и последующей стабилизации

Индустриальным партнером – ООО «РУСХИМБИО» — за счет внебюджетных средств проведен анализ эффективности выявления маркерных частиц на мембранах тест-систем при различных режимах регистрации сигнала.

Иностранным партнером – Национальным центром биотехнологии Республики Казахстан, Астана – сформирована панель антигенов приоритетных инфекций крупного рогатого скота (бруцеллеза, туберкулеза и лейкоза) и антител против них. Получены штаммы-продуценты рекомбинантных антигенов – белков возбудителей бруцеллеза, туберкулеза и лейкоза, проведены наработка и очистка рекомбинантных белковых препаратов и моноклональных антител к ним.

• Проведена характеристика иммунохимических реагентов для серодиагностики лейкоза, бруцеллеза и туберкулеза крупного рогатого скота, полученных Иностранным партнером. Для характеристики прочности взаимодействия пар антиген-антитело и определения кинетических и равновесных констант комплексообразования использовали биосенсорный подход, основанный на явлении поверхностного плазмонного резонанса. Для исследованных пар антигенов с антителами полученные значения кинетических констант ассоциации находятся в диапазоне 10^4 – 10^6 1/Ms, а кинетических констант диссоциации – в диапазоне 10^(-3) – 10^(-5) 1/s. Полученные значения кинетических констант свидетельствуют о высокоаффинном взаимодействии иммунных пар. Синтезированы конъюгаты иммунореагентов для серодиагностики бруцеллеза, туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота с нанодисперсными носителями, Охарактеризован их состав, стабильность и реакционная способность в иммунохроматографии.
• Проведена сравнительная характеристика возможных форматов тест-системы для мультиплексной экспрессной серодиагностики бруцеллеза, туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота. Оптимизирован состав мультимембранного композита, концентраций и сочетаний иммунохимических компонентов. Апробированы возможные подходы к реализации иммунохроматографической серодиагностики с использованием колориметрической и флуоресцентной детекции сигнала. Изготовлены экспериментальные образцы тест-системы для экспрессной серодиагностики бруцеллеза, туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота. Исследованы метрологические характеристики тест-системы на репрезентативной выборке биопроб.
• Проведено дополнительное патентное исследование. По его результатам подготовлена заявка на патент для защиты интеллектуальной собственности на результаты проета. предложенные при разработке тест-систем и обеспечивающие повышение чувствительности и достоверности серодиагностики при контроле трех заболеваний крупного рогатого скота.

Иностранным партнером – Национальным центром биотехнологии Республики Казахстан – подготовлена и охарактеризована панель биопроб крупного рогатого скота для валидации разрабатываемых тест-систем для диагностики лейкоза, бруцеллеза и туберкулеза с использованием нескольких методов. Осуществлена передача реагентов и обмен данными о результатах тестирования компонентов разрабатываемых тест-систем. Получена дополнительная панель штаммов-продуцентов рекомбинантных антигенов, антигены ящура и лептоспироза крупного рогатого скота и антитела против них.

• Изучены концентрационные зависимости иммунохимических взаимодействий рекомбинантных белков возбудителей ящура, лептоспироза и выработаны рекомендации по оптимальному соотношению используемых реагентов в тест-системе для одновременного определения до 5 заболеваний крупного рогатого скота.
• Исследована стабильность характеристик тест-системы для одновременного определения трех возбудителей заболеваний крупного рогатого скота в режиме ускоренного старения. Разработаны методы контроля качества тест-систем.
• Совместно с иностранным партнером проведены испытания тест-системы для одновременного определения до 3 заболеваний крупного рогатого скота. Подготовлен лабораторный регламент изготовления тест-системы для экспрессной серодиагностики до 5 заболеваний крупного рогатого скота.
• Проведена апробация экспериментальных образцов тест-системы для одновременного определения до 3 заболеваний крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах нескольких регионов РФ.
• Изготовлены экспериментальные образцы тест-системы для экспрессной серодиагностики до 5 заболеваний крупного рогатого скота.
• Разработана программа исследовательских испытаний, содержащая методики и этапы тестирования и позволяющая количественно оценить качество тест-систем для экспрессной серодиагностики до 5 заболеваний крупного рогатого скота по параметрам чувствительности, специфичности и точности количественных измерений.
• Проведены исследовательские испытания тест-систем для экспрессной серодиагностики до 5 заболеваний крупного рогатого скота по разработанной программе и методикам исследовательских испытаний и статистическая обработка результатов испытаний.
• Разработаны инструкции по применению двух разработанных тест-систем для экспрессной диагностики заболеваний крупного рогатого скота.
• Проведено дополнительное патентное исследование в соответствии с ГОСТ 15.011-96 для оценки патентоспособности разработанного методического решения для экспрессной серодиагностики крупного рогатого скота. Подана заявка на патент.
• Подготовлен проект технического задания на проведение ПНИЭР по теме «Создание технологии производства тест-системы для одновременного определения трех заболеваний крупного рогатого скота и тест-системы для одновременного определения пяти заболеваний крупного рогатого скота».
• Подготовлен проект методических рекомендаций по применению тест-систем для экспрессной диагностики заболеваний крупного рогатого скота.
• Разработаны требования к приборному обеспечению для производства разработанных изделий – тест-системы для одновременного определения трех заболеваний крупного рогатого скота и тест-системы для одновременного определения пяти заболеваний крупного рогатого скота. Подготовлены рекомендации по применению результатов проекта, в том числе по взаимодействию с потенциальными изготовителями и потребителями аналитических наборов.
• Проведено тестирование изготовленных образцов тест-системы для одновременного определения до 5 заболеваний крупного рогатого скота.
• Проведена характеристика корреляции между результатами диагностики с использованием тест-системы для одновременного определения до 5 заболеваний крупного рогатого скота и альтернативных аналитических методов.

Проведена сдача-приемка исполненных обязательств Получателя по Соглашению о предоставлении гранта. По поданным заявкам № 2020131639 и № 2019144499 получены патенты РФ на изобретения: «Способ повышения чувствительности иммунохроматографического серодиагностического анализа с использованием двух маркеров» (патент № 2739752) и «Способ иммунохроматографической серодиагностики с последовательным добавлением реагентов» (патент № 2741199). Выполнение работ за счет финансирования из бюджетных и внебюджетных средств на 4 этапе проекта не предусмотрено.

Получение новых ферментных препаратов гидролитического действия для биодеградации целлюлозосодержащих материалов на основе штаммов-продуцентов целлюлаз, полученных методом направленной эволюции.

• Проведен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной и методической литературы, относящейся к тематике использования различных подходов рационального дизайна ферментов, востребованных промышленной биотехнологией. В обзоре проведено сравнение эффективности подходов направленной эволюции белков и точечного мутагенеза с точки зрения увеличения каталитической активности и термостабильности гидролаз.
• Проведен анализ структуры полинуклеотидных последовательностей генов cbhI и eglII с точки зрения соответствия частот используемых кодон для экспрессии в штамме дрожжей Pichia pastoris. Рекомендованы структуры для синтетических генов cbhIsyn и eglIIsyn.
• Проведено тестирование экспрессионной системы гриба Penicillium canescens для создания комплексных мультиферментных штаммов, содержащих мутированные формы целлобиогидролазы I и эндоглюканазы II, полученные ранее с помощью сайт- направленного мутагенеза.
• Были разработаны две методики: Лабораторная методика определения кинетических параметров целлюлаз и Лабораторная методика определения операционной стабильности целлюлаз.
• Проведено выделение гомогенных форм нативных и мутантных целлюлаз (cbhI и eglII) из рекомбинантных штаммов гриба Penicillium canescens. Для гомогенных форм проведено сравнение биохимических свойств, а также проведены эксперименты по стабильности индивидуальных целлюлаз в ионных жидкостях и высокосолевых растворах.

• Наработаны жидкие и сухие формы ферментного препарата, полученного при культивировании рекомбинантных штаммов Penicillium canescens, продуцентов комплекса целлюлаз ЦБГI и ЭГII с модифицированной поверхностью. Модификция поверхности заключалась в введении аминокислотных замен в сайты поверхностного N-гликозилирования.
• Определен компонентный состав новых ферментных препаратов, показано, что доля модифицированных ферментов составляет от 10 до 40% от общего количества секретируемого белка.
• Оптимизирован рост рекомбинантных штаммов P.canescens в процессе ферментации. Показано, что наилучший результат по выходу общего белка наблюдается в случае использования соевой шелухи и кукурузного экстракта в количестве (г/л): соевая шелуха-4,0, кукурузный экстракт- 5,0.
• Клонирован ген eglII модифицированной эндоглюканазы, полученный в результате применения методик SeSam и KnowVolution, суть которых состоит неупорядоченном мутагенезе гена eglII в применением ep-PCR с последующим отбором колоний на чашках с аморфной целлюлозой и прогревом при 80С c одновременным биоинформатическим анализом белковой структуры эндоглюканазы II. Данная методика позволяет определить перспективные области для насыщающего мутагенеза. Эксперимент проводился немецкими коллегами и в качестве реципиента были выбраны дрожжи Pichia pastoris. Далее мутантный ген eglII (с финальными мутациями: S114P, Y293F, S305F, S308P) был синтезирован для экспрессии в реципиентном штамме P.canescens RN3-11-7, клонирован. Был осуществлен скрининг мутантных штаммов и отобраны 2-а трансформанта для дальнейшей работы. Критерий отбора состоял в наибольшем уровне экспрессии мутантной ЭГII.

• Клонированы и экспрессированы гены мутантных целлюлаз eglII и cbhI в системе экспрессии гриба Penicillium canesens RN 3-11-7. Структура генов была передана Иностранным партнером после проведения 2-х раундов неупорядоченного мутагенеза по технологии Knowvolution c последующей рекомбинацией аминокислотных замен по методике OmniChange, проведенной в клетках дрожжей Pichia pastoris.
• Отобраны рекомбинантные штаммы ЭГII и ЦБГI, содержащие мутации для обеспечения повышенной термостабильности и для устойчивости в высокосолевых растворах. Для ЭГII – S308P/S114P/Y293F/S305F (термостабильность), F16L/Q289G/Y293F (устойчивость в высокосолевых растворах и ионных жидкостях). Для ЦБГI – A65R/S181F/G415R (термостабильность) и A65R/S181F/G415R/V267N/D269S (устойчивость в высокосолевых растворах и ионных жидкостях).
• Была проведена наработка экспериментальных образцов (лабораторных образцов и опытных партий), выделены гомогенные формы мутантных белков и проведено сравнение их биохимических свойств по отношению к немутированным формам целлюлаз.
• Показано, что pH-оптимум мутантных белков сравнимы с pH-оптимумом нативных ферментов. Каталитические активности также значительно не изменились. Однако, по результатом ДСК термостабильность мутантов выросла на 7oС в случае ЭГII, и на 5oС в случае ЦБГI.
• Стабильность мутантов в высокосолевых растворах измерялась в 1- и 2-х кратной морской воде. Показано, что для мутанта ЭГII, F16L/Q289G/Y293F, стабильность выросла в 1,1 раза. Однако, высокосолевой раствор оказывал стабилизирующее действие и на нативную форму белка. Стабильность же мутантной ЦБГI (A65R/S181F/G415R и A65R/S181F/G415R/V267N/D269S) в высокосолевых растворах значительно выросла. За 10 мин реакции гидролиза МКЦ нативная форма ЦБГI теряет 40% активности, а мутант A65R/S181F/G415R/V267N/D269S лишь 10% (65оС и pH 4.0).
• Разработана техническая документация в составе: Лабораторный технологический регламент получения модифицированных ферментных препаратов целлюлазы, Рекомендации и предложения по использованию результатов исследования. Проведена технико-экономическая оценка полученных результатов.

На 4-м (заключительном) этапе выполнения работ по проекту выполнялись работы по регистрации патента (предоставлена копия патента на изобретение № 2741078 от 22.01.2021 г), а также работы по подготовке итогового резюме по проекту, аналитической справке о выполнении проекта, отчета о расходах, а также отчета о достижении значений показателей результативности использования гранта в форме субсидии.

Разработка прогноза реализации следующих приоритетных направлений научно-технологического развития Российской Федерации:

• переход к высокопродуктивному и экологически чистому агро- и аквахозяйству,
• разработка и внедрение систем рационального применения средств химической и биологической защиты сельскохозяйственных растений и животных,
• хранение и эффективная переработка сельскохозяйственной продукции,
• создание безопасных и качественных, в том числе функциональных, продуктов питания.

Прогноз должен быть сформирован с учётом имеющегося потенциала (кадрового, инфраструктурного, производственного, логистического и т.д.) и коммуникационных возможностей на территории Российской Федерации, а также возможных международных (экстерриториальных) связей с научным, инженерным и предпринимательским сообществом отдельных стран и (или) макрорегионов.

• Разработаны анкеты для проведения экспертных опросов и глубинных интервью по Приоритету.
• Построена  аналитическоая карта, отражающая  рынки (сектора экономики), развитие которых обеспечивается реализацией приоритета; ключевые технологии, ожидаемые в рамках реализации приоритета, а также областей науки и техники, развитие которых может обеспечить его реализацию.
• Осуществлена оценка качественных и, в случае возможности определения – количественных параметров рынков продуктов и (или) услуг, значимых социальных задач, развитие которых обеспечивается при реализации Приоритета.
• Подготовлен предварительный перечень законодательных и социальных барьеров для развития рынков товаров, услуг и технологий.

Основные результаты, полученные на 2 этапе выполнения проекта:

• Осуществлен социологический опрос;
• Проведены экспертные опросы и глубинные интервью;
• Проведены семинары с участием ведущих экспертов сферы науки, технологий и предпринимателей;
• Определен перечень ожидаемых продуктов и (или) услуг, непосредственно связанных с реализацией Приоритета, являющихся наиболее существенными для рынков, и (или) решения социальных задач, включая их возможные качественные характеристики;
• Сформирован детализированный перечень технологий, необходимых для создания продуктов и (или) услуг, непосредственно связанных с реализацией Приоритета, в том числе имеющих самостоятельное значение (права на которые могут стать самостоятельным объектом продажи на существующих или формирующихся рынках технологий);
• Подготовлен детализированный перечень научных задач (проблем), решение которых необходимо для получения конкурентоспособных технологий и (или) достижения новых качеств товаров и (или) услуг, непосредственно связанных с реализацией Приоритета;
• Сформирован детализированный перечень направлений исследований и разработок, которые могут существенным образом повлиять на развитие технологий, характеристики товаров и (или) услуг, будущие рынки (оценка потенциального влияния развития науки и технологий на рынки) связанных с реализацией Приоритета;
• Подготовлены сведения о российских и зарубежных организациях и их структурных подразделениях (лабораториях), являющихся по тем или иным показателям, лидерами соответствующих областей (отраслей) науки и техники;
• Осуществлена оценка ресурсного потенциала в рассматриваемой области, включая оценку кадрового потенциала, материально-технической базы науки и производства; оценка имеющихся научно-технических заделов, в том числе охраняемые объекты интеллектуальной собственности, имеющие критическое значение для развития рассматриваемой сферы;
• Проведен анализ законодательных и социальных барьеров для развития рынков товаров, услуг и технологий, связанных с реализацией приоритета;
• Проведена стратегическая сессия с участием ведущих экспертов сферы науки, технологий и предпринимателей по приоритету;
• Подготовлены обоснованные предложения по возможным комплексным научно-техническим программам, обеспечивающим реализацию приоритета;
• Представлены основные результаты в форме краткого публичного прогнозно-аналитического доклада по реализации приоритета;
• Разработаны возможные сценарии реализации приоритета, сформированных с учетом влияния внешних и внутренних научно-технологических, социально-экономических и политических факторов, взаимоувязанные со сценариями научно-технологического развития российской федерации;
• Подготовлены карты (ландшафтов, матриц) ожидаемых рынков и «сквозных технологий» (технологий, оказывающих существенное влияние на реализацию иных приоритетов научно-технологического развития);
• Оценены финансовые, кадровые, организационные и другие ресурсы, необходимых для реализации комплексных научно-технических программ приоритета;
• Осуществлено аналитическое, информационное и научно-методическое обеспечение деятельности Совета.

Основные результаты, полученные на третьем этапе проекта:

• Сформированы перечни ожидаемых продуктов, услуг, технологий и научных задач, перечень направлений исследований и разработок Приоритета.
• Агрегированы сведения о российских и зарубежных организациях — лидерах соответствующих областей науки и техники.
• Обозначены барьеры развития рынков товаров, услуг и технологий.
• Сформулированы предложения по реализации эффективной государственной политики.
• Разработаны рекомендации по определению и корректировке научно-технологических приоритетов исследований и разработок.
• Подведены итоги экспертных опросов и глубинных интервью.
• Произведена оценка ресурсного потенциала в рассматриваемой области.
• Подготовлены обоснованные предложения по возможным комплексным научно-техническим программам.
• Обозначены финансовые, кадровые, организационные и другие ресурсы, необходимые для реализации комплексных научно- технических программ приоритета.
• С формулированы возможные сценарии реализации приоритета.
• Разработаны карты (ландшафтов, матриц) ожидаемых рынков и «сквозных технологий» (технологий, оказывающих существенное влияние на реализацию иных приоритетов научно-технологического развития).
• Представлен отчет об аналитическом, информационном и научно-методическом обеспечении деятельности Совета. Для построения аналитических выводов были использованы:

а) данные социологических опросов (проводятся в рамках исследования) и анализ «больших данных» новостных и иных открытых российских и зарубежных ресурсов;
б) анализ ключевых российских и зарубежных стратегических и прогнозных документов, прогнозов крупных корпораций и консалтинговых агентств;
в) результаты обработки и анализа информации по данным Web of Science (Scopus), массивы открытых публикаций, в том числе включающих публикации российских авторов в разрезе тематических направлений развития науки и технологий, патентных баз данных Всемирной организации интеллектуальной собственности, базы данных Организации экономического сотрудничества и развития и ЕврАзЭС;
г) экспертные опросы и глубинные интервью (не менее 100 опрошенных экспертов, не менее 10 глубинных интервью с ведущими мировыми экспертами);
д) стратегические сессии и семинары с участием ведущих экспертов сферы науки, технологий и предпринимателей (не менее 5 мероприятий, не менее 100 участников накопленным итогом).

Основной целью совместного проекта является изучение взаимосвязи структуры и противотуберкулезной активности новых соединений – производных 2-тиопиридинов, тиенопиримидинов и пираноиндолов, дизайн и синтез соединений в этих трех рядах и комплексное исследование их влияния на метаболизм микобактерий и противотуберкулезную активность в in vitro и in vivo моделях.

Для достижения поставленной цели необходимо решение ряда задач:

• синтезировать новые производные в трех рядах соединений — 2-тиопиридинов, тиенопиримидинов и пираноиндолов, среди которых уже выявлены соединения обладающие целевой активностью:
• исследовать противотуберкулезную активность полученных соединений как на растущих, так и на не делящихся клетках:
• изучить взаимосвязь между структурой и активностью и на основе полученных данных синтезировать наиболее активные соединения, которые могли бы быть подвергнуты углубленному изучению как кандидаты в лекарственное средство:
• выявить их молекулярной мишени и механизм действия в клетке M. tuberculosis что является на сегодняшний день обязательным условием успешного развития нового препарата.

• Проанализированы последние достижения в области создания соединений с противотуберкулезной активностью. Рассмотрено современное состояние терапии туберкулеза. Анализ основных направлений исследований в области создания соединений с противотуберкулезной активностью показал, что наиболее перспективным путем создания новых высокоэффективных препаратов является комплексный подход, включающий скрининг соединений в отношении как полноклеточных форм микобактерий, так и в отношении дормантных форм, подробное генетическое исследование резистентных мутантных штаммов и проведение секвенирования чувствительных штаммов микобактерий, подвергнувшихся обработке препаратами для поиска потенциальных мишений.
• Проведены патентные исследования по ГОСТ 15.011-96. Отчет о проведенных патентных исследованиях по теме «Лекарственные средства на основе 2-тиопиридина, тиенопиримидина и пираноиндола, для лечения туберкулеза» представлен в составе отчетной документации 1-го этапа отдельным документом.
• Проведено теоретическое исследование путей создания новых противотуберкулезных препаратов. Показано, что только комплексный подход к направленному поиску противотуберкулезных препаратов нового поколения имеет шансы на успех. Такое направление исследований должно включать как скрининг в отношении полноклеточных форм микобактерий, так и скрининг в отношении дормантных форм с одной стороны, и подробное генетическое исследование, как резистентных мутантных штаммов, так и чувствительных штаммов, подвергнувшихся обработке.
• Осуществлен дизайн и синтез новых производных в двух рядах соединений – 2-тиопиридинов (34 соединения) и пираноиндолов (35 соединений).
• Проведено тестирование физико-химических свойств 34-х синтезированных соединений производных 2-тиопиридина и 35-ти синтезированных соединений производных пираноиндола. На основе проведенных работ разработаны протоколы тестирования физико-химических свойств образцов соединений производных 2-тиопиридина и пираноиндола, которые представлены в составе отчетной документации 1-го этапа отдельным документом.
• Получена библиотека соединений производных 2-тиопиридина, включающая 34 соединения и библиотека соединений производных пираноиндолов, включающая 35 соединений. Каждое вещество из библиотек соединений охарактеризовано по своим физико-химическим свойствам, в том числе данными 1Н ЯМР, данным элементного анализа (CHN-анализ), данным масс-спектрометрии, данным ИК- спектроскопии.
• Проведено изучение цитотоксичности полученных соединений производных 2-тиопиридина и пираноиндола в отношении клеточных линий карциномы легкого человека (А-549) и HepG2.
• Проведено исследование противотуберкулезной активности полученных соединений производных 2-тиопиридина и пираиндола как на растущих (штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv), так и на не делящихся клетках (штамм Mycobacterium tuberculosis ss18b). Изучена взаимосвязь между структурой синтезированных соединений и их противотуберкулезной активностью. Было установлено, что несколько 1-гидрокси-2-тиопиридинов с фрагментом изотиомочевины во втором положении проявляют высокую активность в отношении лабораторного штамма микобактерий туберкулеза H37Rv. Исследование влияния различных заместителей во фрагменте изотиомочевины в положении 5 пиридинового кольца показало, что соединения с тетрагидропиримидиновым остатком проявляли чуть менее выраженную противотуберкулезную активность, по сравнению с их близкими аналогами – соединениями, имеющими меньший размер цикла заместителя. При этом не наблюдается никакой противотуберкулезной активности для соединений с атомами H, Me или Cl в положении 5 пиридинового кольца 4а-с (МИК > 100 мкг/мл). Только соединения, имеющие в этом положении сильный электроноакцепторный заместитель, такой как алкоксикарбонил или трифторметил группы, проявляли высокую противотуберкулезную активность. В результате проведенного in vitro скрининга были отобраны 10 соединений лидеров производных 2-тиопиридина и 5 соединений лидеров производных пираноиндола для дальнейшего углубленного изучения в качестве кандидатов для создания лекарственного средства.
• Для выявления молекулярной мишени в клетке M. tuberculosis и механизма действия соединений лидеров – кандидатов в лекарственное средство для лечения туберкулеза на данном этапе выполнения работ словацким пратнером была разработана аналитическая платформа, включающая результаты оптимизации определения МИК для не патогенных модельных организмов Mycobacterium tuberculosis H37Ra и Mycobacterium bovis BCG, результаты оптимизации условий введения радиоактивной метки в различных средах, результаты оптимизации аналитических методов для мониторинга введения радиоактивной метки в ДНК, РНК, белки, клеточную стенку и нуклеотиды, результаты оптимизации определения градиента протонов в микобактериях, а также результаты валидации разработанных методических подходов на примере противотуберкулезных препаратов с известным механизмом действия.

На втором этапе работ:

• осуществлен дизайн и разработаны методы синтеза новых соединений производных тиенопиридина (35 соединений);
• наработаны экспериментальные образцы и 35 соединений производных тиенопиридина в количестве 100 мг каждого соединения;
• проведено тестирование физико-химических свойств 35-ти синтезированных соединений производных тиенопиридина. На основе проведенных работ разработан протокол тестирования физико-химических свойств образцов соединений производных тиенопиридина, который представлен в составе отчетной документации 2-го этапа отдельным документом;
• получена библиотека соединений производных тиенопиридина, включающая 35 соединений. Каждое вещество из библиотеки соединений охарактеризовано по своим физико-химическим свойствам, в том числе данными 1Н ЯМР, данным элементного анализа (CHN-анализ), данным масс-спектрометрии, данным ИК-спектроскопии;
• проведено изучение цитотоксичности полученных соединений производных тиенопиридина в отношении клеточных линий карциномы легкого человека (А-549) и HepG2. На основе проведенных работ разработан протокол тестирования цитотоксичности образцов соединений производных тиенопиридина, который представлен в составе отчетной документации 2-го этапа отдельным документом;
• проведено исследование противотуберкулезной активности полученных соединений производных тиенопиридина (штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv). На основе проведенных работ разработан протокол тестирования противотуберкулезной активности образцов соединений производных тиенопиридина, который представлен в составе отчетной документации 2-го этапа отдельным документом;
• в результате проведенного in vitro скрининга были отобраны 10 соединений лидеров производных тиенопиридина для дальнейшего углубленного изучения в качестве кандидатов для создания лекарственного средства;
• изучена противотуберкулезная активность отобранных на первом этапе работ 10 соединений лидеров производных 2-тиопиридина и пираноиндола, и на втором этапе работ 10 соединений лидеров производных тиенопиридина в отношении клинических изолятов штаммов M.tuberculosis характеризующихся множественной устойчивостью к антибиотикам (лекарственно устойчивые штаммы туберкулезной инфекции);
• на основании проведенного сравнительного анализа полученных результатов осуществлен выбор по одному представителю в каждой группе соединений (2-тиопиридинов, тиенопиримидинов и пираноиндолов) для последующего углубленного изучения;
• разработана Программа по углубленному изучению выбранных лидирующих соединений, которая представлена в составе отчетной документации 2-го этапа отдельным документом;
• изучена in vivo на моделях острой и хронической туберкулезной инфекции противотуберкулезная активность отобранных представителей от каждой группы соединений;
• исследовано влияние лидирующих соединений производных 2-тиопиридина, пираноиндола и тиенопиримидина на штамм Micobacterium tuberculosis H37Rv и стрептомицин зависимый штамм Micobacterium tuberculosis 18b разработанными методами для выявления молекулярной мишени в клетках микобактерий и установления механизма действия соединений лидеров;
• разработан 96 – луночный микротест, в котором 100 мкл клеточных культур выращивают в лунках в присутствии ингибиторов и специфичных радиоактивных меток таких как [14C]–ацетат, [14C]–урацил, [14C]–лейцин или [14C]-D-Ala для изучения возможного ингибирования липидов, нуклеиновых кислот, белков и пептидогликана изучаемыми соединениями;
• показано, что соединение 11226084 в концентрации 0,6 мкг/мл и соединение 11626056 в концентрации 40 мкг/мл ингибировали рост культуры M. tuberculosis H37Rv;
• проведена подготовка, демонстрация и популяризация результатов работы на международных конференциях;
• подготовлена публикация «New 1-hydroxy-2-thiopyridines combat Mycobacterium tuberculosis violating copper homeostasis» авторов Salinа E.G., Grigorov A.S., Azhikina T.L., Kaprelyants A.S., Mikusova K., Makarov V.A. в журнале FEBS Journal.

На третьем (заключительном) этапе работ:

• Проведено высоко производительного секвенирования ДНК, изолированной из ото-бранных клонов мутантов M. tuberculosis устойчивых к отобранным наиболее активным соединениям;
• Обнаружены и проверены достоверности мутаций на хромосоме микобактерий туберкулеза, в результате приобретения спонтанной устойчивости клеток к лидирующим соединениям и идентифицированы гены, кодирующие целевые белковые мишени;
• Идентифицирована молекулярная функция мишени как минимум для одной группы соединений;
• Проведены ключевые фармакологические in vitro ADMET тесты с соединениями ли-дерами (из группы тиопиридина 11226084; тиенопиримидина 11126053; пираноиндола 11626056);
• Проведено исследование острой токсичности соединений лидеров в трех группах со-единений (из группы тиопиридина 11226084; тиенопиримидина 11126053; пираноиндола 11626056);
• Проведено обобщение и оценка полученных результатов по сравнению с современ-ным научно-техническим уровнем;
• Проведена подготовка, демонстрация и популяризация результатов работы;
• Подготовлены публикации в научных журналаз, индексируемых в базах данных Scopus и «web of science (WEB of Science);
• Проведены дополнительные патентные исследования;
• Подготовлена и подана заявка на патент, получен патент Российской Федерации на изобретение «Пираноиндолы с противотуберкулезной активностью»;
• Подведены итоги заключительного этапа;
• Подготовлен заключительный отчет и комплект отчетных документов;
• Проведено исследование эффекта лидирующих тиенопиримидинов на метаболизм Mycobacterium tuberculosis (стрептомицин зависимый штамм 18b) разработанными ранее методами (за счет софинансирования из внебюджетных источников);
• Проведено исследование эффекта лидирующих тиенопиримидинов на активность отобранных жизненно необходимых ферментов (за счет софинансирования из внебюджетных источников);
• Получена библиотека штаммов M. tuberculosis с повышенной продукцией белков — мишеней изучаемых соединений для подтверждения их механизма действия (за счет софинан-сирования из внебюджетных источников);
• Определены МИК отобранных лидерных соединений на контрольных штаммах и штаммах с повышенной продукцией заданных ферментов (за счет софинансирования из вне-бюджетных источников);
• Подготовлены публикации в научных журналах, индексируемых в базах данных Scopus и «web of science (WEB of Science) (за счет софинансирования из внебюджетных источ-ников);
• Проведена демонстрация и распространение полученных результатов (за счет софинансирования из внебюджетных источников).

Цель проекта — создание отечественных ферментных препаратов нового поколения, обладающих улучшенными эксплуатационными характеристиками, для применения в кормепроизводстве.

По окончании первого этапа выполнения работ по Соглашению о субсидии №14.607.21.0159 от 03 октября 2016 г. были достигнуты следующие результаты:

• Проведен аналитический обзор научно-технической, нормативной и методической литературы, относящейся к тематике создания ферментных препаратов для кормопроизводства с необходимыми эксплуатационными характеристиками. В обзоре задействовано более 50-ти современных научно-технических ссылок.
• Проведены патентные исследования на тему разработки комплексных ферменных препаратов ксиланаз- целлюлаз. Показано преимущество выбранных в проекте технических решений.
• Проведены теоретические исследования уровня зарубежных и отечественных разработок в области применения ферментных препаратов в кормах моногастричных животных.
• Определены ключевые физико-химические и биохимические параметры ферментных препаратов, влияющих на функциональные свойства кормов. К ним относятся- каталитическая активность и термостабильность.
• Разработаны две лабораторные методики тестирования эксплуатационных характеристик разрабатываемых ферментных препаратов в том числе: методика определения целевых активностей ферментных препаратов в составе кормов и определения вязкости кормов на основе стандартных рецептур для кормления с/х животных и птицы; методика определения операционной стабильности ферментных препаратов, используемых в кормопроизводстве.

• Были получены новые комплексные ферментные препараты двух типов- содержащие преимущественно термостабильную ксиланазу E из Penicillium canescens и базовое количество эндоглюканазы из Peicillium verruculosum в соотношении 5:1 и препараты, где активности термостабильной ксиланазы и эндоглюканазы сбалансированы. Была проведена генетическая модификация ксиланазы Е, направленная на увеличение ее термостабильности, проведен ряд экспериментов, характеризующих биохимические и физические свойства и субстратную специфичность новых ферментных препаратов и модифицированных ксиланаз.
• На основании результатов дополнительных патентных исследований подана Заявка на патент «Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии комплекса ферментов эндоглюканаз и ксиланаз в клетках гриба Penicillium verruculosum и способ получения ферментных препаратов на его основе, предназначенных для кормопроизводства».
• Было проведено моделирование производственного процесса получения ферментных препаратов в лабораторных условиях и на основании результатов моделирования был разработан Лабораторный регламент получения ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов для использования в кормопроизводстве.
• Было организовано экспериментальное кормления с/х животных (поросят мясной породы) и птицы (кур-бройлеров) с целью определения эффективности ферментных препаратов in vivo. Для этого была создана лабораторная модель для тестирования функциональных свойств комьикормов in vitro, даны рекомендации по дозировке новых ферментных добавок. Результаты кормления реальных животных показали целесообразность использования новых ферментных комплексов в кормах.

• Были изучены эксплуатационные характеристики ферментных препаратов ксиланаз/целлюлаз. Определены pH-стабильности и термостабильности новых ферментных препаратов кормового назначения. Установлено, что КМЦ-азная (ЭГ2) и ксиланазная (КсилЕ) активность новых ФП проявлялась в диапазоне рН 3-7 (оптимум рН 4,0-5,5), в диапазоне температуры 20-80°С (оптимум – 60-70°С); КМЦ-азная и ксиланазной активности были стабильны при температурах от 50 до 80°С. Ксиланазная активность новых ФП практически не ингибировалась белковыми ингибиторами ржи. Эти свойства, проявляемые новыми ФП, являются важными положительными факторами при их использовании в качестве кормовых добавок
• Был определен компонентный состав новых ферментных препаратов. С помощью хроматографических методов показано, что состав ФП, полученных на основе новых рекомбинантных штаммов P.verruculosum ЕХ13 и ЕХ35 существенно изменился по сравнению с составом ФП штамма-реципиента в пользу содержания эндодеполимераз, разрушающих НПС: ФП ЕХ13 содержал 16% ЭГ2 и 48% КсилЕ, а ФП ЕХ35 – 58% КсилЕ от общего пула белка, тогда как ФП штамма-реципиента имел в своём составе 45% ЦБГ1, 14% ЦБГ2, 1,4% ЭГ2. Гетерологичный КсилЕ в штамме-реципиенте отсутствовал.
• Было продемонстрировано, что в процессе оптимизации состава питательной среды в лабораторных ферментёрах замена дрожжевого экстракта на кукурузный экстракт и мочевину, кристаллической глюкозы – на глюкозную патоку, и изменения рН ферментационной среды с 4,75 до 5,25, приводит в случае штамма P.verruculosum ЕХ13 к увеличению продуктивности по КМЦ-азной и ксиланазной активности на 46 и 96%, соответственно; в случае штамма P.verruculosum ЕХ35 – к увеличению продуктивности по ксиланазной активности на 47%. Модифицированная питательная среда оказалась на 43% дешевле исходной среды и была рекомендована для применения в промышленном производстве ФП в условиях завода ООО «Агрофермент»- Индустриального партнера проекта.
• Было проведено обобщение результатов работ по теме «Создание отечественных ферментных препаратов нового поколения, обладающих улучшенными эксплуатационными характеристиками, для применения в кормопроизводстве». Технико-экономическая оценка результатов проекта показала преимущество  новых ФП Агроксил Премиум и Агроксил Плюс в качестве кормовой добавки перед импортными аналогами. Основное преимущество отечественных ферментных препаратов состоит в возможности снижения дозировок ФП на тонну корма без изменения эффективности применения. При этом стоимость ферментных препаратов российского производства вдвое ниже коммерчески доступных импортных аналогов.

На 4-м (заключительном) этапе реализации проекта выполнялись работы по регистрации патентов. Также было сформировано итоговое резюме по проекту:

• Сформулированы требования к кормовым ферментным препаратам (ФП) нового поколения, заключающиеся в обеспечении их высокой активности по отношению к некрахмальным полисахаридам (НПС), основным антипитательным компонентам корма моногастричных животных, засчёт: 1) увеличения содержания в них эндодеполимераз (преимущественно, ксиланаз и эндоглюканаз) и уменьшения содержания балластных ферментов; 2) высокой термостабильности ферментов (в особенности при 80°С – температуре грануляции комбикормов); 3) устойчивости ферментов, в первую очередь ксиланаз, к белковым ингибиторам злаков.
• В результате генетической трансформаци игрибного штамма—реципиента Penicillium verruсulosum 537, получен рекомбинантный штамм P.verruсulosum ЕХ13 – продуцент эндоглюканазы (ЭГ2) и ксиланазы (КсилЕ), а также штамм P.verruсulosum ЕХ35 – продуцент КсилЕ.
• Установлено, что КМЦ—азная (ЭГ2) и ксиланазная (КсилЕ) активность новых ФП проявлялась в диапазоне рН 3-7 (оптимум рН 4,0-5,5), в диапазоне температуры 20-80°С (оптимум – 60-70°С); КМЦ—азная и ксиланазной активности были стабильны при температурах от 50 до 80°С. Ксиланазановых ФП была устойчива к действию белковых ингибиторов ржи. Эти свойства, проявляемые новыми ФП, являются важными положительными факторами при их использовании в качестве кормовых добавок.
• В процессе оптимизации состава стандартной питательной среды в лабораторных ферментёрах было продемонстрировано, что замена дрожжевого экстракта на кукурузный экстракт и мочевину, кристаллической глюкозы – на глюкозную патоку, а также изменение рН ферментационной среды с 4,75 до 5,25, приводит в случае штамма P.verruculosum ЕХ13 к увеличению продуктивности по КМЦ—азной и ксиланазной активности в 1,3 и 1,9 раза соответственно; в случае штамма P.verruculosum ЕХ35 – к увеличению продуктивности поксиланазной активности в 1,2 раза. Модифицированная питательная среда была рекомендована для применения в реальном промышленном производстве ФП в условиях завода ООО «Агрофермент».
• На предприятии ООО «Агрофермент» успешно проведены испытания штаммов P.verruсulosum ЕХ13 и ЕХ35 в производственных условиях, проведены промышленные ферментации и наработаны партии гранулированных ФП Агроксил Премиум (на основе штамма P.verruсulosum ЕХ13) и Агроксил Плюс (на основе штамма P.verruсulosum ЕХ35).
• Успешно проведены испытания новых ФП Агроксил Премиум и Агроксил Плюс в качестве кормовой добавки при кормлении растущих поросят и цыплят-бройлеров. Созданные в ходе выполнения проекта продукты – ФП целлюлаз/ксиланаз Агроксил Премиум и Агроксил Плюс на базе мутантных штаммов ЕХ13 и ЕХ35 микроскопического гриба Penicillium verruculosum, соответствуют всем техническим требованиям и показателям Техническогозадания (п.4 ТЗ).

Целью проекта является изучение пространственной организации архитектурных белков (и/или их доменов), а также их функциональных комплексов, контролирующих архитектуру генома и обеспечивающих регуляцию экспрессии генов у дрозофилы D.melanogaster.

Реализация проекта будет способствовать расширению знаний и получению новых значимых научных результатов в области структурной биологии. Для достижения указанной цели планируется совместное использование станции «Белок» НИЦ «Курчатовский институт» и ряда станций Европейского центра синхротронного излучения в части проведения рентгеноструктурного эксперимента и эксперимента по малоугловому рентгеновскому рассеянию.

Проект выполняется под руководством ведущего ученого-координатора: заместителя руководителя группы Структурной биологии Европейского центра синхротронного излучения Кристофа Мюллера-Дикмана (Christoph Müller-Dieckmann).

• Проведен аналитический обзор современной научно-технической литературы, а также патентные исследования в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96.
• Созданы генетические конструкции для отобранных архитектурных белков (и/или их структурных доменов) из D.melanogaster. Проведена экспрессия целевых белков в системе E.coli.
• Выделен и очищен ряд исследуемых белков для последующих структурных исследований.
• Проведен функциональный тест ряда полученных целевых белков на предмет образования комплексов и/или мультимеризации.
• Проведен широкий скрининг и оптимизация условий кристаллизации полученных белковых объектов.
• Получены белковые кристаллы для двух исследуемых объектов.
• Проведено тестирование образцов белковых кристаллов для условий рентгеноструктурного эксперимента на станции «Белок» НИЦ КИ.

С использованием возможностей Европейского Центра Синхротронного Излучения (ESRF) были получены следующие результаты:

Получены пространственные структуры BTB-домена белка Centrosomal Protein 190 (разрешение 1.4А) и ZAD-домена белка Serendipity (разрешение 3.5А). Методом SAXS получены данные низкого разрешения для ZAD-домена белка CG1832, подтвердившие, что белок в растворе представляет собой гомодимер.

• Получен ряд исследуемых белков (функциональных доменов) для последующих структурных исследований.
• Проведен широкий скрининг и оптимизация условий кристаллизации полученных белковых объектов.
• Получены белковые кристаллы для трех исследуемых объектов, а также для одного комплекса.
• Проведено тестирование образцов белковых кристаллов для условий рентгеноструктурного эксперимента на станции «Белок» НИЦ КИ.

С использованием возможностей Европейского Центра Синхротронного Излучения (ESRF) были получены следующие результаты:
Методом рентгеноструктурного анализа получены пространственные структуры для комплекса BTB-домена белка Centrosomal Protein 190 с C-концевым фрагментом белка CTCF (разрешение 2.35А), а также для ZAD-доменов белков  Wek (разрешение 1.9А) и CLAMP (2.0A). Методом SAXS получены данные низкого разрешения для BTB-доменов белков LOLA и BTBVIII, подтвердившие, что белки в растворе представляют собой гомооктамеры.

Целью проекта является исследование пространственных структур белков эукариот, контролирующих архитектуру их генома и обеспечивающих регуляцию экспрессии генов. Для этой цели будут использованы возможности Европейского центра синхротронного излучения в части проведения рентгеноструктурного эксперимента.

Пространственная организация генома имеет важное значение в процессах поддержания архитектуры ядра и регуляции всех процессов, происходящих в нем. Известно, что в процесс регуляции транскрипции у эукариот вовлечены многочисленные элементы генома, зачастую расположенные на значительном расстоянии друг от друга. В последние несколько лет была сформирована концепция, согласно которой существует особый класс архитектурных белков, в числе которых и известные инсуляторные белки, участвующих в организации общей архитектуры хромосом, а также в локальном контроле энхансер-промоторных взаимодействий. Предполагается, что данные белки способны устанавливать дистанционные взаимодействия, а также привлекать различные белковые многокомпонентные комплексы, которые, в частности, могут менять статус окружающего хроматина, однако соответствующие структурные данные и механизмы действия архитектурных белков до сих пор неизвестны. Исходя из этого, особый интерес представляют те архитектурные белки, которые способны, напрямую или путем привлечения других белков-партнеров, формировать белковые комплексы. Данное свойство, с одной стороны, делает возможным специфичное и эффективное сближение дистанционно разделенных регуляторных элементов генома, а с другой — позволяет разделять хроматиновые домены за счет образования хромосомальных петель. Очевидный недостаток структурной информации существенно тормозит развитие исследований в части изучения пространственной организации генома и механизмов регуляции экспрессии генов. Помимо фундаментальной составляющей, такие данные имеют и прикладной интерес. Так, известно, что нарушения, происходящие на уровне архитектуры хромосом, часто напрямую связаны с развитием многих заболеваний человека. Полученные в результате выполнения проекта структурные данные позволят глубже исследовать механизмы протекания заболеваний, связанных с такими нарушениями архитектуры хромосом как, например, онкогенные хромосомные перестройки.

При выполнении работ по проекту были получены следующие результаты:

• Отобран пять архитектурных белков из модельного организма D.melanogaster (включая их структурные домены).
• Отобранные белки получены в количестве и с чистотой, пригодной для их структурных исследований методом рентгеноструктурного анализа.
• Проведен широкий скрининг условий кристаллизации полученных белков. Выращены кристаллы для двух белковых объектов.
• С использованием инфраструктуры ESRF получена пространственная структура BTB-домена белка CP190 с разрешением 2.5А, а для ZAD-домена белка CG17958 получены диффрационные наборы с разрешением 3.67А.
• Структура BTB-домена белка CP190 решена и уточнена.

2. Повышение уровня сложности и расширения перечня выполняемых научно-технических услуг, а также развитие нормативно-методической, метрологической и информационной составляющих ЦКП.

• Выполнен аналитический обзор литературы, обоснование и выбор наиболее эффективных методов и средств, направления исследований и способов решения ПНЗ «Разработка новых методов переработки и использования возобновляемого и техногенного сырья»
• Разработана перспективная программа развития ЦКП
• Разработаны методики выделения и получения препаратов технических ферментов и идентификации секретируемых продуктов и метаболитов
• Проведены исследования для внешних пользователей
• Проведен вебинар и практические занятия со студентами
• Проведены работы за счет внебюджетных средств: подготовлены помещения для установки оборудования, проведена калибровка и поверка оборудования

• Проведены аналитические исследования объектов разработки- реципиентных штаммов метилотрофных дрожжей Pichia pastoris и низших грибов рода Penicillium как основы для гомологичной и гетерологичной экспрессии ферментов и белков технического и медицинского назначения. Использовано более 100 современных ссылок на научно-техническую литературу (соответствие п.2.4 ПГ);
• Разработаны лабораторные методики проведения исследования с использованием нового оборудования: 1) лабораторная методика выделения и получения препаратов технических ферментов на основе штаммов микромицетных грибов и 2) лабораторная методика идентификации и количественного анализа секретируемых микробных продуктов и метаболитов (соответствие пп.2.5 ПГ);
• Проведена оценка уровня продуктивности модифицированных штаммов-микроорганизмов, продуцентов целевых продуктов и метаболитов. Показано, уровень продукции Fab клетками штаммов GS115 и GS115/KAR2 одинаков, а, следовательно этот процесс не лимитирован уровнем внутриклеточного BiP (соответствие п. 2.7.2 ПГ);
• Проведена оптимизация процесса ферментации штаммов дрожжей-продуцентов белковых молекул Pichia pastoris. При исследовании влияния концентрации глюкозы в питательной среде на продуктивность было впервые установлено, что при одинаковом потреблении глюкозы увеличение концентрации глюкозы в 4 раза приводит к увеличению продуктивности штамма в 1.6 раза (соответствие пп. 2.7.4 ПГ);
• Проведена оптимизация процесса ферментации рекомбинантных штаммов-продуцентов технических ферментов карбогидраз. Впервые показано, что для получения наиболее близких к стандарту активностей ферментов, можно заменить в исходной среде половину МКЦ на СИО 87 (сосну измельченную обессмоленную) и полностью в добавках. (соответствие пп. 2.7.5 ПГ).

• Проведена закупка современного дорогостоящего научного оборудования и проведение мероприятий по установке оборудования и пусконаладочные работы;
• Проведена закупка расходных материалов;
• Реализован комплекс мер по повышению доступности приборной базы ЦКП для внешних и внутренних пользователей;
• Обеспечены исследования в интересах внешних пользователей;
• Разработаны рекомендации об использовании полученных результатов, в том числе в реальном секторе экономики, а также в дальнейших научных исследованиях и разработках;
• Проведена технико-экономической оценка рыночного потенциала полученных результатов;
• Опубликованы материалы исследований;
• Подготовлены помещения для установки закупаемого оборудования;
• Проведено метрологическое обеспечение оборудования;
• Проведено обучение научных кадров;
• Проведено текущее содержание оборудования.

• Получено 4 экспериментальных образца рекомбинантных штаммов инулиназ. В результате исследования их гидролитической способности на предобработанных клубнях и стеблях топинамбура выбрано 2 из них- Penicillium verruculosun INU13 и Penicillium verruculosum INU18.
• Наработаны 7 экспериментальных образцов сухих ферментных препаратов, включая инулолитические и целлюлолитические ферментные препараты.
• Наработаны 3 экпериментальных образца биокатализатора получения фумаровой кислоты, представляющие собой гриб Rhizopus oryzae F-1032.
• Наработаны 6 экпериментальных образцов биокатализаторов получения молочной кислоты, 3 из которых на основе бактериальных L. casei В-3960 и 3 из которых на основе грибного штамма Rhizopus oryzae F-814. Оба биокатализатора были иммобилизованы на поливиниловом спирте.
• Разработаны Программы и методики испытаний экспериментальных образцов новых ферментных препаратов для гидролиза предобработанного сырья на лабораторном оборудовании, а также образцов молочной и фумаровой кислот в новых гидролизных средах.
• Наработаны партии предобработанного растительного сырья для проведения ферментативного гидролиза. Получено 5 образцов. Использованы физико-химические методы предобработки, а именно: 1) получена партия механически измельченного свекловичного жома, 2) партия механически измельченных клубней топинамбура, 3) партия стеблей топинамбура, обработанного органозольвом, а также партия 4) стеблей топинамбура и 5) измельченных осиновых опилок, обработанных кислотой.
• Наработаны партии ферментных препаратов в объемах 10 л культуральной жидкости.
• Наработаны партии гидролизатов предобработанного растительного сырья с разными комбинациями ферментных препаратов. Всего получено 16 образцов гидролизатов. Показано, что для наработки конечного продукта фумаровой и молочной кислоты наиболее перспективным и экологически чистым сырьем являются измельченные клубни топинамбура.
• Наработаны и испытаны партии фумаровой и молочной кислоты в новых гидролизных средах в соответствии с разработанными ПМ.

• Проведено исследование экспериментальных образцов новых ферментных препаратов и описаны их свойства. Определен компонентный состав новых ферментных препаратов INU13 и INU18, полученных на основе культуральной жидкости рекомбинантных штаммов P.verruculosum PVERINU13 и P.verruculosum PVERINU18. Показано, что ферментный препарат INU13 содержит 45% целевой гетерологичной инулиназы Asp.awamori, в то время как препарат INU18 – 28,5%.
• Были определены биохимические свойства ферментных препаратов INU13 и INU18 такие как рН-оптимум, Т-оптимум и термостабильность препаратов при стандартном наборе температур (50, 55, 60, 65 и 70С). Все эти характеристики определяют операционную стабильность новых ферментных препаратов, которая является основной эксплутационной характеристикой при использовании на производстве. Показано, что, рН оптимум препаратов равен 5, T-оптимум – 60С по инулину топинамбура. Также показано, что препарат INU13 является более стабильным в условиях повышенных температур, чем препарат INU18.
• Было проведено исследование экспериментальных образцов штаммов микроорганизмов-продуцентов фумаровой кислоты в новых гидролизных средах. Анализ установленных концентраций побочных продуктов в анализируемых средах показал, что максимальное накапливание этанола происходит в гидролизатах клубней аргентинского топинамбура и превосходит аналогичные характеристики в других средах в 3,5-6 раз.
• Было проведено исследование экспериментальных образцов штаммов микроорганимов-продуцентов молочной кислоты в новых гидролизных средах. Показано, что степень конверсии глюкозы в молочную кислоту максимальна в случае использования аргентинского топинамбура в качестве субстрата.
• Были изучены характеристики исходного растительного сырья. Для этого был проведен анализ инулина в клубнях топинамбура в соответствии с планом-графиком уборки культуры в Липецкой области. Было показано, что доля фруктоолигосахаридов с высокой степенью полимеризации свойственна клубня, собранным в конце сентября. Затем происходит рост содержания олигосахаридов с низкой степенью полимеризации и сахарозы.
• Были разработаны 3 лабораторных регламента (ЛТР), а именно: ЛТР получения ферментных препаратов с повышенной гидролитической особенностью по отношению к предобработанной возобновляемой биомассе, ЛТР получения фумаровой кислоты и ЛТР получения молочной кислоты.
  

• Проведено исследование продуктов после предобработки растительного сырья, в т.ч. состава простых сахаров, олиго- и полисахаридов, органических кислот и других компонентов в зависимости от источника растительного сырья. В качестве образцов выбраны стебли и клубни топинамбура в условиях различной хранимости, собранные в период с сентября по ноябрь. Показано, что лучше хранение переносят клубни, собранные в конце сентября, т.к. в них меньше сахарозы и больше инулоолигосахаридов высокой степени полимеризации. Кроме того, в них выше содержание сухих веществ.
• Проведены поиск и изучение ингибиторов процессов биоконверсии растительного сырья и разработаны условия предобработки, направленные на минимизацию их негативного влияния на выход целевого продукта. Изучены возможности разделения С5- и С6- сахаров в процессах предобработки стебле топинамбура. Определено негативное влияние ацетат-ионов на процесс конверсии сахаров в органические кислоты.
• Разработаны и оптимизированы комплексы карбогидраз для использования в процессе ферментативной конверсии растительных полисахаридов в простые сахара. Исследованы особенности синергетических взаимодействий ферментов в составе карбогидразного комплекса. Было показано, что в случае использования смеси компонентов целлюлаз ЦБГI и ЭГII, взятых в соотношении (3,75+1,25 мг/г) с дополнительным содержанием экзоинулиназы (3 мг/г сухого субстрата) наблюдали 62,5 г/л ВС, что на 25% выше результата осахаривания стеблей только экзоинулиназой и на 48% выше по сравнению с выходом сахаров при гидролизе только ферментными препаратами целлюлаз.
• Исследовано влияние растительных полифенольных соединений на эффективность карбогидраз. Изучена адсорбционная способность карбогидраз на лигнине.
• Разработан и оптимизирован процесс культивирования штаммов-продуцентов кар-богидраз. Изучение влияния состава сред и условий проведения ферментаций на биосинтез целевых ферментов. Показано, что снижение микрокристаллической целлюлозы в стартовой среде культивирования приводит к существенному снижению затрат при получении целевого ферментативного комплекса.
• Исследованы и оптимизированы постферментационные процессы, в т.ч. процессы отделения культуральной жидкости от биомассы, процессы концентрирования культуральной жидкости и ее стабилизации.
• Наработаны экспериментальные образцы ферментных препаратов INU13 и INU18, полученные на основе рекомбинантных штаммов, и проведены их испытания в соответствии с Программами и методиками их испытаний, разработанными ранее.
• Внесены корректировки в лабораторный регламент получения ферментных препаратов INU13 и INU18 с учетом новых данных. В частности, изменена стадия ионообменной очистки гидролизата клубней, а также произведена замена дрожжевого экстракта на соевую муку.

По окончании пятого этапа выполнения работ по Соглашению о субсидии №14.607.21.0050 от 25 августа 2014 г. были достигнуты следующие результаты:

• Исследованы продукты реакции ферментного гидролиза предобработанного растительного сырья, клубней топинамбура. Показано, что продукты ферментативного гидролиза представлены в основном фруктозой и глюкозой. Получены данные о положительном влиянии иммобилизации свободных клеток гриба Rhizopus oryzae для процесса микробиологического синтеза фумаровой кислоты.
• Разработан и оптимизирован процесс генерации и культивирования микроорганизмов, секретирующих карбоновые кислоты. Экспериментально установлено, что в случае выбора режима проведения процесса с подпитками субстратом не зависимо от концентрации сахаров в среде продуктивность процесса постепенно снижается на протяжении всего времени культивирования за счет накопления в среде целевого продукта и токсичных метаболитов, вызывающих ингибирование скорости процесса в целом. Однако, при периодическом режиме отмечается стабильная работа иммобилизованных биокатализаторов-продуцентов в ходе биоконверсии ферментолизатов растительного сырья в органические кислоты.
• Разработан процесс выделения и очистки карбоновых кислот из культуральной среды. Установлено, что полученный в результате проведения анионообменной хроматографии раствор фумаровой кислоты далее целесообразно подкислить 0,1 М HCl и выдержать при 4оС в течение 24-28 ч, а затем отфильтровать.
• Разработана Лабораторная методика синтеза биополимера на основе фумаровой кислоты.
• Проведены работы по моделированию всего процесса биоконверсии растительного сырья в карбоновые кислоты. В результате проведенных исследований можно сделать вывод о том, что  разработанный процесс биоконверсии ферментолизатов растительного сырья в ФК следует проводить в биореакторе в следующих условиях: концентрация ВС 80±10 г/л, в том числе 15±5 г/л глюкозы, концентрация биокатализатора – 300 г/л, соотношение объемов жидкой фазы к газовой 1:2, рН – без внесения нейтрализующих агентов. При периодическом режиме ведения процесса длительность 1 цикла – 72ч.
• Разработан проект технического задания на проведение ОТР по теме: «Биоконверсия некрахмального растительного сырья в органические (окси- и дикарбоновые) кислоты».
• Проведена технико-экономической оценка результатов проекта.

Объектом разработки является эукариотическая система экспрессии, позволяющая получить экспрессию бактериальных генов в низших грибах рода Aspergillus и Penicillium. Новизна разработки состоит в попытке экспрессии уникальных термофильных целлюлаз, являющихся компонентами целлюлосомы грам-положительной бактерии Clostridia termocellum в разработанной и высокопродуктивной экспрессионной системе низших грибов.
Целью проекта является создание новых продуктивных рекомбинантных штаммов микроорганизмов, продуцирующих технические ферменты-бактериальные целлюлазы, обладающие уникальными свойствами при гидролизе целлюлозосодержащего сырья (ЦСС) при совместном участии российских и немецких партнеров.

• Проведен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, относящейся к теме экспрессии гетерологичных генов в эукариотических системах. Проведено сравнение систем, рассмотрены преимущества и недостатки для каждой системы экспрессии. Показано, что экспрессия гетерологичных генов в низших грибах является перспективной задачей, способной решить ряд проблем промышленной биотехнологии.
• Проведен выбор оптимальных реципиентных штаммов низших грибов по следующим критериям: продуктивность, стабильность продукции белков, низкий уровень экспрессии протеаз. К таким штаммам относятся, в том числе, и штаммы Aspergillus awamori и Penicillium canescens.
• Проведен биоинформатический анализ частоты использования кодонов в выбранных штаммах Penicillium и Aspergillus для моделирования синтетических бактериальных генов cel1 и cel2 из Clostridium thermocellum. Подготовлена таблица частоты использования кодонов в выбранных штаммах для передачи данной информации немецким партнерам.
• Проведены патентные исследований в соответствии с ГОСТ 15.011-96. Показано, что оба объекта патентных исследований «Штамм мицелиального гриба Penicillium canescens как основа для получения ферментных препаратов целлюлаз бактериального происхождения» и «Штамм мицелиального гриба Aspergillus awamori как основа для получения ферментных препаратов целлюлаз бактериального происхождения» могут являться базовыми штаммами для использования их в гетерологичной экспрессии бактериальных целлюлаз

• Клонированы синтезированные гены клостридиальных целлюлаз в интеграционный вектор для экспрессии в низших грибах родов Aspergillus и Penicillium.
• Проведена трансформация ДНК-конструкций в реципиентные штаммы Penicillium и Aspergillus. Проведен селективный отбор трансформантов.
• Проведено тестирование положительных трансформантов на вставку гетерологичных генов бактериальных целлюлаз в хромосому грибов рода Aspergillus и Penicillium.
• Проведено тестирование продукции целлюлаз по отработанной методике высокопродуктивного скрининга в плашках.
• Отобраны по 3 наилучших рекомбинантных штамма для каждого клонированного гена клостридиальной целлюлазы по критерию наличия детектируемого гетерологичного белка.
• Проведено культивирование отобранных рекомбинантных штаммов в колбах, в малых объемах (100 мл). Приготовлены жидкие формы ферментных препаратов с использованием микрофильтрации и концентрирования.

Со стороны иностранных партнеров все работы выполнены в запланированном объеме и достигнуты следующие результаты:

• Синтезированы 2-а гена термофильных клостридиальных целлюлаз с оптимизированной структурой и переданы в ИНБИ РАН для клонирования в интеграционные вектора (работа 1.2 1-ого Этапа).
• Разработан подходящий интеграционный вектор для экспрессии в Bacillus — подобран промотор, оператор и лидирующий пептид для индуцибельной высокоэффективной бактериальной экспрессии. Проведено тестирование выбранной системы с маркерным геном (работа 1.5 1-ого Этапа).
• Клонированы новые синтезированные гены целлюлаз с оптимизированной структурой в подобранный бактериальный вектор для экспрессии в бактериях рода Bacillus.
• Проведена трансформация ДНК-конструкций в штамм-реципиент Bacillus и выбраны штаммы с множественной интеграцией в хромосому.
• Проведен первый раунд скрининга: выбраны наилучшие трансформанты с высоким уровнем продукции целевого белка в культуральных плашках.

• Культивированы отобранные рекомбинантные штаммы грибов рода Penicillium и Aspergillus в 1-л ферментерах на стандартной среде культивирования. В качестве контроля выбран штамм-реципент Penicillium canescens RN3-11-7. За экспрессией гетерологичных белков CELL, CELS, CELR и CELT следили электрофоретически.
• Проведен анализ биосинтеза бактериальных целлюлаз в течение ферментации. Показано, что собственная протеолитическая активность штамма не влияет на струкуру и функцию собственных секретируемых белков, однако, является критической для гетерологичных клостридиальных целлюлаз в особенности CELL и CELT. Показано, что использование ионов Ca2+ в качестве добавки к стандартной среде культивирования, содержащей соеву шелуху, кукурузный экстракт и отруби, стабилизирует экспрессию белков CELS и CELR и приводит к получению 50% недеградируемого бека в секретируемой жидкости рекомбинантных штаммов.
• Были подобраны условия стабилизации жидких форм ферментных препаратов клостридиальных целлюлаз, представляющие собой ультраконцентрированные культуральные жидкости, собранные после 6-ти дней культивирования ркомбинантных грибов.
• Тестирование секреции клостридиальных целлюлаз в грибных штаммах в течение 5 пассажей показало наличие гетерологичной полосы у рекомбинантных штаммов-продуцентов белков CELS и CELR. Интенсивность полосы, соответствующей гетерологичному белку оставалась неизменной. Результаты MALDI-TOF спектрометрии показали соответствие полосы целлюлаз искомым клостридиальным целлюлазам.
• Были проведены дополнительные патентные исследования для определения новизны и уровня техники изобретения «Новый рекомбинантный штамм мицелиального гриба Penicillium canescens CS15, продуцирующий целлюлазу Clostridium thermocellum, и способ его культивирования». Исследования показали, что технический результат, получаемый при реализации разработанных технических решенийбудет являться новым и даст возможность эффективной продукции целлюлазы из  Clostridium thermocellum в гетерологичном хозяине Penicillium canescens RN3-11-7.

• Проведены дополнительные патентные исследования с целью определения патентоспособности промежуточных результатов ПНИ. Показано, что рекомбинантный штамм Penicillium canescens CL14, продуцент клостридиальной целлюлазы Cel5L обладает признаками новизны и рекомендован к патентованию. Штамм депонирован в Всероссийскую коллекцию микроорганизмов.
• Оптимизированы условия получения сухих форм ферментных препаратов для четырех штаммов- продуцентов бактериальных целлюлаз CELS, CELR, CELL и CELT. Показано, что необходимым компонентом культивирования соответствующих рекомбинантных штаммов является хлорид кальция в концентрации 10 мМ. Схема подачи хлорида кальция – дробная. Также рекомендовано добавление пепстатина в количестве 3*10-5М в качестве ингибитора собственных протеаз штамма Penicillium canescens.
• Получены экспериментальные образцs сухих форм ферментных препаратов клост- ридиальных целлюлаз CELS, CELR, CELL и CELT. А также их аналогов с 6*His-Taq на С-конце.
• Используя афинную хроматографию, выделены и очищены индивидуальные рекомбинантные целлюлазы CELS и СELR из сухих ферментных препаратов, полученных на основе рекомбинантных штаммов низших грибов Penicillium. Описаны их свойства, в частности, субстратная специфичность. Принадлежность белка в смываемых фракциях к CELS или CELR доказана с использованием MALDI-TOF анализа.
• Разработан лабораторный регламента получения ферментных препаратов бактериаль- ных целлюлаз в эукариотических системах экспрессии на примере получения CEL5L клостридиальной целлюлазы.
• Определены возможности эффективного связывания очищенных рекомбинантных бактериальных целлюлаз с другими компонентами клостридиальной целлюлосомы in vitro, в частности, со скаффолд –белком cipA. Показано, что, вероятнее всего, связывание cipA белка происходит только с С-концом бактериальных целлюлаз. Предложены варианты решения данной проблемы методами белковой инженерии бактериальных целлюлаз.

По окончании пятого этапа выполнения работ по Соглашению о субсидии №14.616.21.0002 от 09 сентября 2014 г. были достигнуты следующие результаты:

• Проведено тестирование отобранных рекомбинантных штаммов Penicillium и Aspergillus, продуцирующих клостридиальные целлюлазы CelL, СelS, CelR и CelT в лабораторных ферментерах, объемом 10 л.  Основными параметрами тестирования являлись стабильность секреции целевых целлюлаз, а также вязкость ферментационной среды. Также показано, что добавление ионов Са2+ в концентрации 10 мМ оказывает стабилизирующее действие на секрецию гетерологичных белков.
• Подобраны производственные параметры ферментационного процесса, такие как тип инокуляции, условия индукции, скорость аэрации. Показано, что при переходе от 1-л к 10-л объемам культивирования сохраняется линейность параметров.
• Проведена технико-экономическая оценка результатов проекта. Показано, что при экспрессии гетерологичных белков на уровне 15% от общего пула секретируемых белков, процесс культивирования целлюлосомальных белков  становится экономически оправданным в случае экспрессии их в мицелиальном грибе Penicillium canescens.
• На основе полученных в проекте данных разработан проект технического задания на проведение ОТР по теме: «Экспрессионные системы для высокопродуктивной гетерологичной экспрессии бактериальных экзоферментов, востребованных промышленной биотехнологией».

Цели исследования:

• оценка и прогнозирование угроз экологического характера, связанных с выпуском в окружающую среду ГМ растений, в целях снижения экологической нагрузки на природу и обеспечения экологической безопасности РФ
• моделирование процедуры оценки экологического риска, возникающего при выпуске ГМ растений в окружающую среду
• формулирование основных видов потенциальных экологических угроз, возникающих при выпуске ГМ растений в окружающую среду
• разработка требований, направленных на предотвращение реализации экологических рисков и бесконтрольное распространение генно-инженерно модифицированных организмов (ГМО) при проведении экспериментальных полевых испытаний ГМ растений.

• Проведено комплексное исследование и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы по системам оценки угроз экологического характера, связанных с выпуском ГМ растений в открытые системы,  показано наличие позитивного опыта стран ЕС, США, Казахстана в этой области. В обзоре литературы представлена разработанная Международными организациями, в частности Организацией экономического сотрудничества и развития  методическая база, которая предназначена для использования при оценке потенциальных рисков ГМ растений регуляторными органами стран, использующих ГМО.
• Выполнено обоснование и выбор направления исследований и способов решения поставленных задач.
• На научной базе сформулированы понятия риска, опасности, их взаимосвязи, пути выявления потенциальных угроз. Выявлены основные фенотипические и генотипические характеристики ГМ растений, обуславливающие появление потенциальных экологических угроз.
• Определен перечень основных видов потенциальных экологических угроз, возникающих при выращивании ГМ растений в окружающей среде.
• Разработана научно-методическая модель оценки экологического риска, возникающего при выпуске ГМ растений в окружающую среду.
• Рекомендации по снижению потенциальных экологических угроз при использовании ГМ растений в открытых системах.
• Разработаны предложения по гармонизации нормативной базы проведения оценки и прогнозирования угроз экологического характера, связанных с выпуском в окружающую среду ГМ растений, стран Таможенного союза и Евразийского экономического сообщества (ЕврАзЭС). Подготовлены проекты: а) Соглашения ЕврАзЭС об обращении ГМР, а также ГМ продукции; б) Единых правил государственной регистрации ГМР, а также ГМ продукции на территории ЕврАзЭС и ТС; в) Единых требований по ввозу и обращению ГМР и (или) ГМ-продукции на территории ЕврАзЭС и ТС.
• Разработан перечень требований к полевым испытаниям ГМ растений, направленный на предотвращение реализации экологических рисков при выращивании ГМ растений в открытых системах с исследовательскими целями.
• Предложен комплекс методов (молекулярной диагностики, генной инженерии и т.п.) для детекции распространения ГМО и рекомбинантных ДНК в окружающей среде и определения степени и/или вероятности реализации потенциальных угроз экологического характера и их воздействия на окружающую среду.
• Разработан проект технического задания на проведение ОТР по теме: «Разработка Регламента оценки экологического риска генно-инженерно-модифицированных растений, устойчивых к насекомым-вредителям, при выпуске на территории РФ».
• Осуществлены анализ и оценка результатов исследований, который показывает, что техническое задание выполнено в полном объеме, а выполненная разработка может обладает новизной и полнотой, которая позволяет рассматривать ее как часть стратегии экологической безопасности на территории России в части агробиотехнологии.

Высокая востребованность тест-систем для контроля микотоксинов определяется их ключевой ролью для оценки качества сельскохозяйственных культур. Объемы международной торговли такой продукцией, как пшеница, рис, ячмень, кукуруза, соя и масличные культуры, составляют сотни миллионов тонн в год. В зависимости от уровня содержания микотоксинов определяется сортность пшеницы, что может оказать радикальное влияние на экспортный потенциал отечественной продукции. Исходя из этого, своевременный и тщательный контроль содержания микотоксинов как в готовой продукции, так и на всех стадиях ее производства является неотъемлемой и важной частью повышения экономического благосостояния страны.

Проект непосредственно направлен на создание и характеристику прототипных образцов иммуноаналитических систем, которые рассматриваются как объекты последующих опытно-конструкторских работ. Работы по проекту включают изготовление и апробацию экспериментальных образцов тест-систем, а также подготовку документации для масштабируемых технологий производства тест-систем.

• Пределы обнаружения антигенов в данной тест-системе варьировали в диапазоне 20 пг/мл – 2 нг/мл в зависимости от определяемого соединения. Указанные пределы обнаружения микотоксинов согласуются с аналитическими характеристиками ИФА и ИХА в соответствии нормативными требованиями к уровню контаминации микотоксинами. На основе полученного массива данных отобраны антитела для дальнейшей работы.
• Проведен скрининг ряда коммерческих и синтезированных в рамках проекта конъюгатов микотоксинов с белком носителем или ферментной меткой (3-7 соединений на каждый из 6 микотоксинов).
• Полученные конъюгаты испытывались как в ИФА/ИХА системах, так и в решениях на основе поверхностного плазмонного резонанса, что дает возможность получить количественные оценки иммуноспецифического взаимодействия. На основании экспериментальных данных по амплитудам сигнала и константам связывания отобраны конъюгаты, обладающие наибольшей потенциальной эффективностью в ИХА и ИФА.
• Получены наноразмерные носители для иммуноферментного и иммунохроматографического анализа. Препараты охарактеризованы методами просвечивающей электронной микроскопии и динамического светорассеяния. Результаты показали высокую степень гомогенности размеров синтезированных препаратов. Получены конъюгаты с антителами и проведена их характеристика методами иммуноферментного анализа и атомно-силовой микроскопии. Показана стабильность препарата магнитных наночастиц со средним диаметром 10 нм и золотых со средним диаметром 25-30 нм, конъюгированного с антителами. 

В ходе выполнения проекта по Соглашению от 5 июня 2014 г. № 14.607.21.0015, дополнительное соглашение от 13 мая 2015 г. №1 с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 2 в период с 1 января 2015 г. по 30 июня 2015 г. выполнялись следующие работы:

• Исследование степени сохранения оптических и магнитных свойств наноразмерных носителей при разных режимах получения межмолекулярных конъюгатов.
• Исследование степени сохранения иммунохимических свойств иммунореагентов при разных режимах получения межмолекулярных конъюгатов с наноразмерными носителями; выбор реагентов, которые в ходе анализа обеспечивают формирование детектируемых соединений или межмолекулярных комплексов.
• Обоснование оптимальной комплектации тест-систем, включая требования к антигенам, антителам, наноразмерным носителям, мембранным носителям, маркерам, детектирующей технике.
• Разработка требований к методам пробоотбора.
• Разработка требований к методам пробоподготовки. Оценка полноты экстракции микотоксинов из биопроб.
• Разработка требований к выборкам биоматериала для апробации тест-систем. Формирование репрезентативных выборок растительных биопроб для характеристики тест-систем.
• Подготовка и оснащение производственных помещений.

Получены следующие основные результаты:

• Проведена оценка сохранения свойств наномаркеров при разных режимах получения конъюгатов. Для золотых наночастиц, конъюгируемых с антителами, показано отсутствие агрегационных процессов; при этом наблюдается сдвиг среднего диаметра на 15 нм, отражающий изменения структуры поверхности. Для магнитных частиц показано сохранение как структуры, так и магнитных свойств агрегатов.
• Синтезированные конъюгаты охарактеризованы по степени сохранения специфических свойств антител, входящих в их состав. Выбраны соотношения компонентов в составе конъюгатов, обеспечивающие наибольшую интенсивность аналитического сигнала при минимальном расходовании иммуноглобулинов – 10-15 мг антител на мл коллоидной суспензии.
• Предложены оптимальные комплектации иммуноферментных и иммунохроматографических тест-систем для определения микотоксинов, обеспечивающие простоту выполнения анализа, минимизацию дополнительного оборудования и реагентов и снижающие себестоимость тест-систем.
• Разработаны требования к методам пробоотбора, учитывающие гетерогенность анализируемого субстрата и неравномерность распределения контаминированных участков. Установлены схемы забора проб и требования к их объему, позволяющие получить объективную картину контаминации партии продукции в целом.
• Проведена разработка требований к методам пробоподготовки, включающих процедуры измельчения, перемешивания, экстракции и очистки анализируемых проб растительного сырья. Проведена экспериментальная оценка степени экстракции при использовании различных водно-органических смесей.
• Показана эффективность использования смеси метанол:вода (70:30) для экстракции афлатоксина В1, охратоксина А, зеараленона и Т-2 токсина.
• Полученные характеристики компонентов тест-систем подтверждают потенциальную возможность создания средств высокочувствительного иммуноанализа для детекции микотоксинов в сельскохозяйственной продукции.

На средства индустриального партнера, ООО «Русхимбио», проведены предусмотренные проектом работы по подготовке разрабатываемого продукта к конечной характеристике и коммерциализации. На основании приоритетных объектов контаминации (основных поражаемых сельскохозяйственных культур) для каждого микотоксина разработаны требования к выборкам анализируемых биопроб для испытаний тест-систем. Сформированы репрезентативные выборки для апробации разрабатываемых средств детекции микотоксинов. Производственные помещения для выпуска тест-систем, разрабатываемых в рамках проекта, оснащены общетехнологическим оборудованием, включающим системы кондиционирования и очистки воздуха. Проведена подготовка зоны производства иммунохроматографических тест-систем, в т.ч. оборудования для контроля и поддержания влажности помещений ниже 30%, установка производственного оборудования для очистки и отвода воды.

В ходе выполнения проекта по Соглашению от 5 июня 2014 г. № 14.607.21.0015, дополнительные соглашения от 13 мая 2015 г. №1, от 08 сентября 2015 г. №2 с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 3 в период с 1 июля 2015 г. по 31 декабря 2015 г. выполнялись следующие работы:

• Разработка протоколов проведения анализа с использованием полученных реагентов

—  для экспрессного внелабораторного иммунохроматографического контроля с мультипараметрической детекцией;

— для высокочувствительного лабораторного иммуноферментного контроля;

— для экспрессного внелабораторного иммуноферментного контроля с визуальной детекцией.

• Получение и характеристика градуировочных кривых для оценки содержания микотоксинов в биопробах; оценка влияния компонентов тест-систем на время анализа, предел обнаружения и рабочий диапазон тест-систем .
• Разработка методик изготовления экспериментальных образцов тест-систем.
• Исследование требований к комплектациям тест-систем, обеспечивающим достижение оптимальных функциональных характеристик; подготовка рекомендаций по выбору оптимальных комплектаций  тест-систем.
• Изготовление экспериментальных образцов  тест-систем.
• Сравнительная характеристика экспериментальных образцов  тест-систем; характеристика иммунохимических реакций, происходящих в разрабатываемых тест-системах; определение концентрационных и кинетических закономерностей взаимодействий в ходе анализа.
• Подготовка и подача заявки для защиты интеллектуальной собственности на результаты ПНИ, относящейся к методике проведения экспрессного иммуноанализа.
• Оборудование технологической линии для производства иммуноферментных тест-систем.
• Апробация оборудования для количественной регистрации результатов измерений.
• Проведение мероприятий по освещению и популяризации разработок.

Получены следующие основные результаты:

• Разработаны протоколы проведения иммунохроматографического, экспрессного иммуноферментного и иммуноферментного анализа с хемилюминесцентной детекцией с использованием полученных ранее реагентов. Проведено исследование требований к комплектациям тест-систем, обеспечивающим достижение оптимальных функциональных характеристик. Определены концентрационные и кинетические закономерности иммунных взаимодействий, происходящих в ходе всех трех видов анализа. Подготовлены рекомендации по выбору оптимальных компонентов тест-систем. Проведены необходимые оптимизации основных концентраций реагентов, обеспечивающих достижение заявленных результатов.
• Получены и охарактеризованы градуировочные кривые определения афлатоксина В1, охратоксина А. зеараленона, Т-2 токсина, фумонизина В1 и ДОНа. С использованием полученных градуировочных кривых проведена оценка содержания микотоксинов в биопробах – экстрактах сельскохозяйственных культур. Проанализировано влияние основных компонентов тест-систем на время анализа, предел обнаружения и рабочий диапазон детектируемых концентраций микотоксинов.
• Подготовлены и поданы две заявки на патенты РФ на изобретения: «Способ проведения иммунохроматографического анализа с высокой степенью выявления маркера» (заявка № 2015156958 от 30.12.2015) и «Способ проведения высокочувствительного иммунохроматографического анализа с прединкубацией иммунореагента и пробы и усилением детектируемого окрашивания» (заявка № 2015156960 от 30.12.2015).
• Разработаны методики изготовления экспериментальных образцов тест-систем с указанием необходимых реагентов, длительности всех стадий изготовления, концентраций реагентов. Изготовлены экспериментальные образцы тест-систем для проведения дальнейших испытаний.

На средства индустриального партнера, ООО «Русхимбио», проведены предусмотренные проектом работы по оборудованию технологической линии для производства иммуноферментных тест-систем. Проведена апробация для количественной регистрации результатов измерений, а также мероприятия по освещению и популяризации разработок.

В ходе выполнения проекта по Соглашению от 5 июня 2014 г. № 14.607.21.0015, дополнительные соглашения от 13 мая 2015 г. №1, от 08 сентября 2015 г. №2 с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 4 в период с 1 января 2016 г. по 30 июня 2016 г. выполнялись следующие работы:

• Разработка рекомендаций по документированию результатов анализа с использованием разработанных тест-систем.
• Разработка программы и методик исследовательских испытаний экспериментальных образцов тест-систем.
• Разработка и обоснование требований к репрезентативной выборке биопроб для проведения исследовательских испытаний экспериментальных образцов тест-систем.
• Проведение исследовательских испытаний экспериментальных образцов тест-систем и статистическая обработка результатов испытаний.
• Определение пределов обнаружения микотоксинов, рабочих диапазонов, количественная характеристика воспроизводимости результатов анализов с использованием экспериментальных образцов разработанных тест-систем.
• Апробация экспериментальных образцов тест-систем для анализа растительного материала.
• Сравнительная характеристика разработанных тест-систем и других видов иммунохимического анализа микотоксинов.
• Подготовка методических рекомендаций по применению тест-систем.

Получены следующие основные результаты:

• В ходе выполнения данного этапа проекта были подготовлены и разработаны рекомендации по документированию результатов анализа, проводимого с использованием созданных иммуноаналитических тест-систем, разработаны Программы и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов тест-систем.
• Была проведена разработка и обоснование требований к репрезентативной выборке биопроб для проведения исследовательских испытаний экспериментальных образцов тест-систем. На основе полученных данных было выполнено определение пределов обнаружения микотоксинов, рабочих диапазонов, представлена полная количественная характеристика воспроизводимости с использованием экспериментальных образцов разработанных тест-систем.
• Была проведена апробация экспериментальных тест-систем, внесены корректировки по ее результатам и проведены повторные испытания. Разработаны методические рекомендации по применению создаваемых тест-систем.

На средства индустриального партнера ООО «Русхимбио» проведены предусмотренные проектом работы по апробации оборудования, входящего в цепочку производства иммуноферментных тест-систем, проведено оборудование технологической линии для производства иммунохроматографических тест-систем. Подготовлены проекты инструкций, технических условий и лабораторных регламентов изготовления тест-систем. Проведены мероприятия по освещению и популяризации разработок, разработан бизнес-план производства создаваемых тест-систем.

В ходе выполнения проекта по Соглашению от 5 июня 2014 г. № 14.607.21.0015, дополнительные соглашения от 13 мая 2015 г. №1, от 08 сентября 2015 г. №2 с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 5 в период с 1 июля 2016 г. по 31 декабря 2016 г. выполнялись следующие работы:

• Разработка рекомендаций по разработке тест-систем для детекции микотоксинов, обеспечивающих применение предложенных в рамках проекта методических решений для анализа новых объектов.
• Подготовка и подача заявки для защиты интеллектуальной собственности на результаты пни.
• Подготовка проекта технического задания на проведение ОТР по теме «создание технологии производства биотехнологических средств комплексного контроля микотоксиновой контаминации зерновой сельскохозяйственной продукции и продуктов ее переработки».
• Оценка полноты решения задач и эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем.
• Разработка рекомендаций по практическому применению результатов пни, в том числе, созданных объектов интеллектуальной собственности.

Получены следующие основные результаты:

• В ходе выполнения данного этапа разработаны рекомендации по созданию тест-систем, обеспечивающих применение предложенных в рамках проекта методических решений для анализа новых объектов.
• Подготовлена и подана заявка для защиты интеллектуальной собственности на результаты ПНИ, описывающая новый метод цветовой дифференциации контрольной и аналитической зон за счет использования наночастиц золота разного цвета.
• Подготовлен проект технического задания на проведение ОТР по теме «Создание технологии производства биотехнологических средств комплексного контроля микотоксиновой контаминации зерновой сельскохозяйственной продукции и продуктов ее переработки».
• Проведена оценка полноты решения задач и эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем. Положительно оценены созданные в ходе выполнения проекта иммунохимические системы определения практически значимых микотоксинов – афлатоксина B1, дезоксинива-ленола, зеараленона, фумонизина B1, T-2 токсина, охратоксина A. Показано, что они соответствуют современному научно-техническому уровню, а в некоторых своих аспектах превосходят его.
• Разработаны рекомендации по практическому применению результатов ПНИ, в том числе созданных объектов интеллектуальной собственности.

На средства индустриального партнера ООО «Русхимбио» проведен комплекс работ, предусмотренных календарным планом на данном этапе проекта. Проведены мероприятия по освещению и полпуляризации разработок. Проведены предусмотренные проектом работы по апробации оборудования, входящего в цепочку производства иммунохроматографических тест-систем. Разработаны проекты методик контроля качества при масштабируемом производстве тест-систем. Подготовлены проекты технических условий на производство тест-систем. Разработана маркетинговая стратегии продаж тест-систем. Проведены испытания тест-систем с участием потенциальных конечных пользователей, продающих и реализующих компаний. Получены положительные отзывы на созданную продукцию. Проведены мероприятия по информационной поддержке планируемой коммерческой реализации тест-систем. Проведена технико-экономическая оценка рыночного потенциала полученных результатов.

• Построены пространственные структуры приоритетных бета-лактамов и фторхинолонов. Их сравнительная оценка позволила определить сходные функциональные группы и составить структурную модель сайтов распознавания для групп-специфических антител. Выбраны методы оценки структурно-функциональных корреляций на основе метода QSAR при разработке индивидуальных и класс-специфических методик иммуноанализа. Составлена панель реагентов для иммуноанализа на основании коммерчески доступных препаратов, реагентов, ранее полученных российскими и китайскими участниками проекта. Изучены антиген-связывающие свойства используемых в работе антител. Получены конъюгаты исследуемых антибиотиков с белками-носителями разной природы, конъюгаты маркеров (флуоресцеин, пероксидаза хрена и коллоидное золото) со специфическими антителами, которые будут использованы для разработки тест-систем. Комплексы антител с нанодисперсными носителями охарактеризованы с помощью таких методов, как просвечивающая электронная микроскопия, атомно-силовая микроскопия, анализ результатов видеоцифровой регистрации иммунохимических взаимодействий в проточных системах.
• Осуществлено измерение кинетических и равновесных параметров реакции как в микропланшетной иммуноферментной системе, так и с использованием биосенсорной системы Biacore. Для измерения равновесных и кинетических констант иммунохимической реакции применены подходы, основанные на анализе зависимости связывания антител с иммобилизованным антигеном от концентрации антигена в растворе в условиях, когда количество образующихся на носителе комплексов пренебрежимо мало и не вызывает сдвига равновесия в растворе. Полученные результаты обеспечивают формирование необходимой реагентной базы для выполнения последующих задач проекта.

В ходе выполнения проекта на этапе № 2 в период с 1 января 2015 г. по 30 июня 2015 г. выполнялись следующие работы:

• Сравнительная оценка особенностей кинетического гетерогенного (иммунохроматографического), равновесного гетерогенного (иммуноферментного) и гомогенного (поляризационного флуоресцентного) иммуноанализа по отношению к характеристикам перекрестной реактивности структурно близких соединений.
• Сравнительная характеристика вклада различных структурных элементов определяемых соединений в процесс иммунного распознавания.
• Разработка дополнительных методических решений по модуляции специфичности, предела обнаружения и рабочего диапазона иммуноанализа.
• Разработка методик проведения индивидуального и класс-специфического иммуноопределения ветеринарных препаратов различных химических классов.
• Проведение дополнительных патентных исследований. Подготовка и подача заявки для защиты интеллектуальной собственности на методические решения, предложенные при разработке иммунохимических методик детекции ветеринарных препаратов.
• Изготовление экспериментальных образцов тест-систем для проведения иммунохроматографического, иммуноферментного и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа ветеринарных препаратов в пищевых продуктах.
• Разработка Программы и методик испытаний экспериментальных образцов тест-систем.
• Формирование репрезентативной панели проб пищевых продуктов для валидации разработанных тест-систем с учетом приоритетных объектов при контроле пищевой безопасности в РФ и Китае.
• Теоретический анализ требований, предъявляемых к методам контроля контаминант с регулируемой специфичностью.
• Характеристика возможностей снижения предела обнаружения в хемилюминесцентном иммуноферментном анализе ветеринарных препаратов.
• Наработка и скрининг иммунореагентов и определение режимов проведения иммунохимических взаимодействий в разрабатываемых тест-системах.
• Определение метрологических характеристик разрабатываемых методик иммуноанализа ветеринарных препаратов.

Получены следующие основные результаты:

• В рамках экспериментального сравнения трех разрабатываемых типов тест-систем показана возможность варьирования специфичности анализа.
• Показана возможность управления специфичностью анализа с помощью изменения структуры определяемого антибиотика.
• Предложены решения, позволяющие в 5-10 раз снизить предел детекции и в 2-5 раз расширить рабочий диапазон тест-систем.
• Подана заявка на патент РФ на изобретение № 2015125368 от 26.06.2015 «Способ экспрессного иммунохроматографического определения соединений в широком диапазоне концентраций».
• Созданы иммунохимические тест-системы для определения как индивидуальных антибиотиков фторхинолонового ряда, так и суммарного содержания препаратов одного класса; разработаны методики проведения анализа с помощью данных тест-систем.
• Для валидации разработанных систем сформирована панель проб пищевых продуктов, включающая образцы молока, молочных продуктов, мяса, яиц и меда. Оценка эффективности работы тест-систем будет проведена на основании разработанных Программы и методик испытаний.
• Иностранным партнером (Южно-Китайский Сельскохозяйственный Университет, г. Гуанчжоу, Китай) проведен теоретический анализ требований, предъявляемых к методам контроля соединений с регулируемой специфичностью, сравнение колориметрической и хемилюминесцентной детекции в иммуноферментном анализе. Партнерами получены новые иммунореагенты, позволяющие расширить специфичность разработанных тест-систем.

В ходе выполнения проекта на этапе № 3 в период с 1 июля 2015 г. по 31 декабря 2015 г. выполнялись следующие работы:

• Сравнительное изучение протоколов пробоподготовки и пробоотбора при определении ветеринарных препаратов в различных пищевых продуктах, в том числе сравнение особенностей нормативных требований РФ и Китая.
• Характеристика влияния матрикса тестируемых проб на результаты детекции ветеринарных препаратов разработанными методами иммуноанализа.
• Проведение совместных испытаний экспериментальных образцов разработанных тест-систем с участием российской и китайской стороны.
• Оценка достоверности получаемых результатов детекции ветеринарных препаратов в различных пищевых продуктах путем сравнения данных иммунохимического и хроматографического анализа.
• Подготовка лабораторных регламентов изготовления разработанных тест-систем с учетом результатов совместных испытаний.
• Информирование потенциальных производителей и конечных пользователей тест-систем в РФ и Китае.
• Проверка эффективности средств прогнозирования специфичности иммуноаналитических тест-систем при перенесении разработанных подходов на другие объекты – контролируемые токсичные контаминанты пищевой продукции.
• Оценка полноты решения поставленных задач. Подготовка рекомендаций по применению установленных закономерностей индивидуального и класс-специфического иммуноанализа и разработанных тест-систем для определения ветеринарных препаратов в пищевой продукции, в том числе – по разработке масштабируемых технологий производства тест-систем. Разработка плана использования результатов проекта, полученных совместно с иностранным партнером.
• Определение критериев контроля качества иммунореагентов для использования в разрабатываемых тест-системах.
• Изучение влияния компонентов реакционной среды на кинетику и специфичность иммунного взаимодействия при детекции ветеринарных препаратов с использованием разработанных методик иммуноанализа.
• Участие китайского партнера в проведении совместных испытаний экспериментальных образцов разработанных тест-систем.
• Характеристика методических решений, обеспечивающих полноту выявления целевых соединений в матриксах проб сложного состава.
• Оценка конкурентного потенциала разработанных тест-систем.

Получены следующие основные результаты:

• Проведено сравнительное изучение протоколов пробоподготовки и пробоотбора при определении ветеринарных препаратов в различных продуктах питания, проведено сравнение особенностей нормативных требований РФ и Китая.
• Охарактеризовано влияние матрикса анализируемых проб на аналитические характеристики разработанных тест-систем и на результаты анализа.
• В рамках двусторонних визитов российских и китайских участников проекта проведены совместные испытания экспериментальных образцов разработанных иммунохимических тест-систем. Достоверность получаемых результатов определения антибиотиков подтверждена путем сравнения с данными хроматографического анализа.
• Подготовлены лабораторные регламенты изготовления разработанных тест-систем с учетом результатов проведенных испытаний.
• Проведено информирование потенциальных производителей и конечных пользователей тест-систем в РФ и Китае.
• Показана эффективность средств прогнозирования специфичности иммуноаналитических тест-систем путем сравнения теоретических данных, полученных с помощью математических моделей QSAR, с экспериментальными данными для разработанных систем.
• Подготовлены рекомендации по применению установленных закономерностей индивидуального и класс-специфического иммуноанализа и разработанных систем.
• Разработан план использования результатов проекта, полученных совместно с иностранным партнером.

Иностранным партнером – Южно-Китайский сельскохозяйственный университет, г. Гуанчжоу — разработаны критерии контроля качества иммунореагентов для использования в разрабатываемых иммунохимических тест-системах. Изучено влияние компонентов реакционной среды на кинетику и специфичность иммунного взаимодействия при детекции ветеринарных препаратов с использованием разработанных методик иммуноанализа. Китайские партнеры принимали активное участие в проведении совместных испытаний экспериментальных образцов разработанных тест-систем. Охарактеризованы методические решения, обеспечивающие полноту выявления целевых соединений в матриксах проб сложного состава. Проведена оценка конкурентного потенциала разработанных тест-систем.

Подведен итог выполненных работ и проведено обобщение результатов исследований за весь период работ, включающий оценку эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем.

Разработка методов оценки безопасности и потенциальных рисков наноматериалов и нанотехнологической продукции, к которым относится выполненный в данном проекте анализ биологического действия наночастиц в отношении клеточных тест-систем, позволит быстро и информативно получить информацию о токсических эффектах наноматериалов, что крайне актуально для осуществления скринингового контроля биобезопасности наночастиц, позволит сформировать критерии влияния наноматериалов на метаболические процессы и охарактеризовать особенности ответов, вызванных экспозицией наноматериалами. Результаты, полученные при изучении действия наночастиц на различные клеточные линии, могут использоваться для оперативной оценки влияния техногенных наноматериалов на изменение биохимических параметров в живых организмах. Это позволит провести адекватную оценку рисков техногенных наноматериалов и разработать эффективную стратегию снижения рисков.

• Проведен анализ требований к референсным материалам, используемым для стандартизации методов детекции ТНЧ и оценки их биологического действия. Экспериментально охарактеризованы существующие и кандидатные референсные материалы, включая оценку их размеров, формы, гетерогенности препаратов, степени агрегированности в различных средах.
• Разработан и экспериментально апробирован комплекс методов выделения, очистки, идентификации и определения содержания ТНЧ в биоматериале, включающий 5 групп ТНЧ, приоритетных для контроля биобезопасности. Проведен сравнительный анализ методов выделения, очистки, идентификации и определения содержания ТНЧ в биоматериале, используемых в отечественной и зарубежной практике. Подготовлена заявка на Евразийский патент по пробоподготовлке сложных биоматриксов для детекции ТНЧ.
• Разработан и экспериментально апробирован комплекс методов ин витро тестирования биологического действия ТНЧ, включающий эксперименты с использованием 2 клеточных культур. Проведен сравнительный анализ методов ин витро тестирования биологического действия ТНЧ, используемых в отечественной и зарубежной практике. Осуществлен сравнительный анализ методов прогнозирования приоритетных органов-мишеней для ТНЧ при разных режимах экспозиции, используемых в отечественной и зарубежной практике. Представлен сравнительный анализ методов прогнозирования комплексного действия ТНЧ на живые организмы и экосистемы, используемых в отечественной и зарубежной практике.
• Результаты работ обсуждались с зарубежным партнером на двусторонних семинарах, а также с привлечением участников проекта «MAnaging RIks of NAnomaterials». Подготовлен протокол о дальнейшем сотрудничестве в рамках международных проектов по нанобиобезопасности.

Цель выполнения научно-исследовательской работы – разработать и апробировать новый аналитический набор для высокочувствительного мониторинга токсичных контаминант, основанный на применении в иммунохроматографическом анализе новых нанодисперсных маркеров и амплификации сигнала. В результате проведенных исследований должны быть разработаны новые методические решения, обеспечивающие снижение предела обнаружения иммунохроматографии по сравнению с традиционными форматами анализа.

Разрабатываемый новый аналитический набор, представляющий собой комплект иммунохроматографических тест-систем и средств концентрирования и пробоподготовки, должен обеспечивать возможность мониторинга объектов окружающей среды и сельскохозяйственной продукции. Аналитический набор должен предназначаться для определения следовых количеств токсичных контаминант: пестициды (сульфомочевины, пиретроиды), детергенты, антибиотики (нитрофураны, бета-агонисты), попадающих в объекты окружающей среды, продукты питания. Аналитический набор должен определять наличие и содержание пищевых токсикантов в объектах окружающей среды (природная и питьевая вода, почвы) и пищевых продуктах животного происхождения (молоко, мясо, продукты их переработки).

В ходе выполнения проекта на этапе № 1 в период с 11 ноября 2015 г. по 31 декабря 2015 г. выполнялись следующие работы:

• Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках исследований, в том числе обзор научных информационных источников: статьи в ведущих зарубежных и (или) российских научных журналах, монографии и (или) патенты).
• Патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96.
• Теоретическая оценка взаимосвязей между характеристиками антител и маркеров, используемых в иммунохроматографии, и пределом детекции целевого аналита; оценка факторов, лимитирующих предел обнаружения иммунохроматографического анализа.
• Разработка согласованных с иностранным партнером требований к характеристикам препаратов антител, нанодисперсных маркеров и их конъюгатов, методик измерений данных характеристик.
• Экспериментальная характеристика антител, используемых для разработки аналитического набора, определение их аффинности и специфичности.
• Экспериментальная характеристика нанодисперсных маркеров, используемых для разработки аналитического набора, определение чувствительности и точности их детекции при проведении анализа на мембранных носителях.
• Теоретическая характеристика возможностей снижения предела обнаружения в иммунохроматографическом анализе при использовании новых видов маркеров и систем амплификации сигнала.
• Разработка и согласование с иностранным партнером требований к характеристикам препаратов антител, нанодисперсных маркеров и их конъюгатов, методик измерений данных характеристик.
• Методика измерений характеристик препаратов антител, нанодисперсных маркеров и их конъюгатов.
• Сравнительный анализ методических решений по амплификации сигнала в иммунохроматографических системах.
• Оценка влияния разных методов амплификации на уровень специфического и неспецифического сигнала в иммунохроматографических системах.
• Сравнительная оценка существующих способов пробоподготовки для иммунодетекции токсичных контаминант окружающей среды и продуктов питания.

Получены следующие основные результаты:

• В рамках первого этапа работ проведен анализ литературных источников по теме исследований.
• Проведены патентные исследования, подтверждающие актуальность и новизну тематики проекта.
• Проведена теоретическая оценка взаимосвязей между характеристиками антител и маркеров, используемых в иммунохроматографии, и пределом детекции целевого аналита; оценка факторов, лимитирующих предел обнаружения иммунохроматографического анализа.
• Разработаны согласованные с иностранным партнером требования к характеристикам препаратов антител, нанодисперсных маркеров и их конъюгатов, методик измерений данных характеристик.
• Экспериментально охарактеризованы антитела и нанодисперсные маркеры, используемые для разработки аналитического набора.

Основными параметрами, использованными для характеристики антител, являлись:
· связывание антител с иммобилизованным конъюгатом целевого антигена и белкового носителя;
· конкурентное взаимодействие антител при введении в систему антитело-конъюгат определяемого соединения;
· специфичность взаимодействия с определяемым соединением;
· достигаемая чувствительность определения в методе иммуноферментного анализа, а также характеристики рабочего диапазона определяемых концентраций.

Соответствующие тестирования были проведены для препаратов антител против целевых антигенов проекта – представителей пестицидов (сульфомочевины, пиретроиды), детергентов, антибиотиков (нитрофураны, бета-агонисты),

Характеристика колориметрических нанодисперсных маркеров заключалась в оценке их размерных параметров методами просвечивающей электронной микроскопии и динамического рассеяния света, а также в оценке их спектральных свойств. Проведено тестирование следующих колориметрических маркеров:
· коллоидное золото;
· окрашенные латексные частицы.

Теоретически охарактеризованы возможности снижения предела обнаружения в иммунохроматографическом анализе при использовании новых видов маркеров и систем амплификации сигнала. Разработаны методики измерений, планируемые к использованию при характеристике препаратов антител, нанодисперсных маркеров и их конъюгатов.

Иностранным партнером – Школа продовольственной науки и техники Университета ЖиангНан, г. Вуси (School of Food Science and Technology, JiangNan University), Китай – проведен сравнительный анализ методических решений по амплификации сигнала в иммунохроматографических системах. Проанализировано влияние разных методов амплификации на уровень специфического и неспецифического сигнала в иммунохроматографических системах. Сопоставлены существующие способы пробоподготовки для иммунодетекции токсичных контаминант окружающей среды и продуктов питания.

В ходе выполнения проекта на этапе № 2 в период с 1 января 2016 г. по 31 декабря 2016 г. выполнялись следующие работы:

• Конъюгирование антител с нанодисперсными маркерами (коллоидным золотом и латексными частицами) при разных условиях проведения взаимодействия.
• Характеристика состава полученных конъюгатов и степени сохранения функциональных свойств.
• Выявление влияния условий синтеза на характеристики полученных конъюгатов наночастиц с антителами.
• Разработка согласованных с китайским партнером требований к панелям проб объектов окружающей среды и продуктов питания.
• Формирование с иностранным партнером панелей проб для апробации аналитического набора для детекции токсичных контаминант: пестицидов, детергентов и антибиотиков.
• Разработка программы и методик испытаний экспериментальных образцов аналитического набора.
• Выбор и обоснование оптимальных протоколов проведения анализа.
• Проведение дополнительных патентных исследований.
• Изготовление экспериментальных образцов аналитического набора.
• Экспериментальное изучение взаимодействий в мембранных иммунохроматографических системах, реализуемых с использованием новых нанодисперсных маркеров и систем амплификации.
• Апробация экспериментальных образцов аналитического набора для тестирования проб реальных образцов объектов окружающей среды и продуктов питания.
• Проведение подтверждающих анализов содержания контаминант (пестицидов, детергентов и антибиотиков) в тестируемых пробах с использованием хроматографических методов.
• Оценка эффективности реализованных методических решений по снижению предела обнаружения в иммунохроматографическом анализе.
• Подготовка лабораторного регламента изготовления разработанного аналитического набора с учетом результатов совместных испытаний.
• Разработка инструкции по применению аналитического набора для определения токсичных контаминант.
• Подготовка рекомендаций по применению результатов проекта и их вовлечению в хозяйственный оборот.
• Разработка плана использования результатов проекта, полученных совместно с иностранным партнером.

Иностранным партнером — Школа продовольственной науки и техники Университета ЖиангНан, г. Вукси (School of Food Science and Technology, JiangNan University), Китай — выполнены следующие работы:

• Охарактеризована специфичность разработанного аналитического набора при контроле структурно близких соединений, относящихся к классам детергентов, пестицидов или антибиотиков.
• Охарактеризована стабильность разработанного аналитического набора при разных режимах хранения, включая режим ускоренного старения.
• Проведены совместные испытания экспериментальных образцов разработанного аналитического набора.
• Проведена оценка эффективности разработанных подходов для контроля различных классов контаминант.
• Проведена оценка конкурентного потенциала разработанного аналитического набора.

Получены следующие основные результаты работ:
В рамках второго этапа работ получены конъюгаты нанодисперсных маркеров (коллоидного золота и латексных частиц) с антителами, изучено влияние условий синтеза на характеристики полученных иммунных комплексов. Разработаны согласованные с китайским партнером требования к панелям проб объектов окружающей среды и продуктов питания, на основании которых сформирована панель проб для апробации аналитического набора. Выбраны оптимальные условия проведения анализа с использованием разработанного аналитического набора. Изготовлены и апробированы экспериментальные образцы аналитического набора, для которых проведена оценка условий хранения, чувствительности и специфичности, определены аналитические характеристики (пределы детекции и рабочие диапазоны).

Подготовлены и поданы две заявки на патенты по результатам исследований:
1)    Способ иммунохроматографического определения низкомолекулярных соединений с прямой концентрационной зависимостью регистрируемого окрашивания;
2)    Способ повышения интенсивности окрашивания иммунохроматографической тест-полоски с использованием неспецифических иммуноглобулинов.

Проведены совместные с китайским партнером испытания экспериментальных образцов аналитического набора. Разработаны следующие документы:
— программа и методики испытаний экспериментальных образцов аналитического набора;
— лабораторный регламент изготовления разработанного аналитического набора с учетом результатов совместных испытаний;
— инструкция по применению аналитического набора для определения токсичных контаминант;
— рекомендации по применению результатов проекта и их вовлечению в хозяйственный оборот;
— план использования результатов проекта, полученных совместно с иностранным партнером.

По результатам работ опубликовано две статьи в журналах, рецензируемых в базе данных Web of Science и Scopus:
1) Comparative characteristics of nanodisperse markers for immunochromatographic test systems;
2) Formats of sensitive immunochromatographic assay: Comparative study on the example of herbicide atrazine

Цель выполнения научно-исследовательской работы – разработать и апробировать новые иммуноаналитические системы для мониторинга био- и антропогенных низкомолекулярных токсикантов в пищевой продукции растительного и животного происхождения. В результате проведенных исследований должны быть разработаны новые методические решения, которые на основании использования новых флуоресцентных маркеров и форматов анализа обеспечивают снижение предела детекции токсичных контаминант по сравнению с существующими методами и позволяют проводить экспрессное тестирование.

Разрабатываемые иммуноаналитические системы должны обеспечивать контроль качества и безопасности продуктов питания (молоко, мясо, продукты их переработки) в части выявления в них наличия и содержания токсичных контаминант (бета-агонисты, бактериостатики и др.). Результатом применения разрабатываемых иммуноаналитических систем в соответствии с методиками их применения должен быть вывод о пригодности или непригодности к использованию тестируемых пищевых продуктов.

В ходе выполнения проекта  на этапе № 1 в период с 11 ноября 2015 г. по 31 декабря 2015 г. выполнялись следующие работы:

• Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках исследований, в том числе обзор научных информационных источников: статьи в ведущих зарубежных и (или) российских научных журналах, монографии и (или) патенты).
• Патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96.
• Характеристика аффинности препаратов немодифицированных антител против низкомолекулярных токсикантов пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков), применяемых в разрабатываемых аналитических системах, методами иммуноферментного анализа.
• Конъюгирование препаратов антигенов и антител с низкомолекулярными и нанодисперсными флуоресцентными маркерами при разных условиях проведения взаимодействия, очистка полученных конъюгатов.
• Определение кинетических и равновесных параметров взаимодействий между реагентами для иммунодетекции токсичных контаминант пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков) с использованием биосенсорного иммуноанализа с регистрацией поверхностного плазмонного резонанса.
• Подготовка и паспортизация препаратов нативных и модифицированных иммунореагентов для включения в панель препаратов, используемых в совместных с итальянской стороной экспериментах по разработке новых иммуноаналитических методов.
• Разработка согласованных с итальянской стороной требований к протоколам проведения экспериментов и формам представления результатов при разработке иммуноаналитических систем.
• Теоретическая и экспериментальная характеристика влияния новых маркеров и форматов проведения иммуноанализа на пределы выявления токсичных контаминант.
• Характеристика селективности препаратов немодифицированных антител против низкомолекулярных токсикантов пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков), применяемых в разрабатываемых аналитических системах.
• Подготовка и паспортизация препаратов нативных и модифицированных иммунореагентов для включения в панель препаратов, используемых в совместных с российской стороной экспериментах по разработке новых иммуноаналитических методов.
• Разработка методических решений для высокопроизводительной и экспрессной пробоподготовки для иммунодетекции токсичных контаминант пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков).

Получены следующие основные результаты:

Подготовлен аналитический обзор современной научнотехнической, нормативной и методической литературы. Проведены патентные исследования по теме проекта. Проведена характеристика аффинности и селективности препаратов немодифицированных антител против низкомолекулярных токсикантов пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков). Получены конъюгаты антигенов и антител с низкомолекулярными нанодисперсными флуоресцентными маркерами. Определены кинетические и равновесные параметры взаимодействий между реагентами. Проведена паспортизация препаратов нативных и модифицированных иммунореагентов. Разработаны методические решения для высокопроизводительной и экспрессной пробоподготовки для иммунодетекции токсичных контаминант пищевой продукции.

В ходе выполнения проекта на этапе № 2 в период с 01 января 2016 г. по 31 декабря 2016 г. выполнялись следующие работы:

• Экспериментальное изучение взаимодействий между иммунореагентами в разрабатываемых аналитических системах для детекции низкомолекулярных токсикантов пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков).
• Выбор и обоснование оптимальных сочетаний реагентов для новых методов контроля низкомолекулярных токсикантов.
• Выбор и обоснование оптимальных протоколов проведения анализа.
• Проведение дополнительных патентных исследований. Подготовка и подача двух заявок на патенты для защиты интеллектуальной собственности на методические решения, предложенные в ходе выполнения проекта.
• Подготовка и паспортизация препаратов пищевых продуктов растительного и животного происхождения для включения в панель препаратов, используемых в совместных с итальянской стороной экспериментах по испытаниям разработанных иммуноаналитических систем.
• Изготовление экспериментальных образцов тест-систем для детекции низкомолекулярных токсикантов пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков).
• Разработка программы и методик испытаний экспериментальных образцов тест-систем.
• Апробация экспериментальных образцов тест-систем для контроля пищевых продуктов растительного и животного происхождения, в соответствии с разработанной программой и методиками испытаний.
• Характеристика точности и воспроизводимости результатов изменений содержания низкомолекулярных токсикантов разработанными методами.
• Сравнительная оценка возможностей применения новых флуоресцентных маркеров для высокочувствительнойдетекциибио- и антропогенных низкомолекулярных токсикантов.
• Экспериментальное изучение эффективности разработанных новых методов экспрессной детекции для контроля низкомолекулярных токсикантов других классов.
• Характеристика стабильности разработанных тест-систем при разных режимах хранения.
• Подготовка лабораторных регламентов изготовления разработанных тест-систем для определения бета-агонистов и бактериостатиков с учетом результатов совместных испытаний.
• Подготовка рекомендаций по применению результатов проекта и их вовлечению в хозяйственный оборот, в том числе по взаимодействию с потенциальными изготовителями и потребителями аналитических наборов.
• Разработка плана использования результатов проекта, полученных совместно с итальянским партнером.
• Подготовка и паспортизация препаратов пищевых продуктов растительного и животного происхождения для включения в панель препаратов, используемых в совместных с российской стороной экспериментах по испытаниям разработанных иммуноаналитических систем.
• Участие в проведении совместных испытаний экспериментальных образцов разработанных тест-систем.
• Проведение подтверждающих анализов содержания низкомолекулярных токсикантов в тестируемых пробах с использованием хроматографических методов для оценки эффективности разработанных методов.
• Сравнение разработанных тест-систем с альтернативными средствами контроля низкомолекулярных токсикантов пищевой продукции; оценка конкурентного потенциала разработанных тест-систем.

Получены следующие основные результаты:
Экспериментально изучены взаимодействия между иммунореагентами в разрабатываемых аналитических системах, выбраны и обоснованы оптимальные сочетания реагентов и протоколы проведения анализа. Поданы две заявки на патенты для защиты интеллектуальной собственности. Изготовлены экспериментальные образцы тест-систем для детекции низкомолекулярных токсикантов пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков) и проведена их апробация для контроля пищевых продуктов растительного и животного происхождения. Проведена характеристика точности, воспроизводимости, стабильности измерений. Подготовлена техническая документация по производству и проведению опытных испытаний тест-систем. Проведены совместные с иностранным партнером испытания экспериментальных образцов тест-систем и подтверждающие анализы с использованием хроматографических методов. Подготовлены рекомендации по применению результатов проекта и их вовлечению в хозяйственный оборот.

• Составлен лабораторный регламент изготовления тест-системы для отбора соединений, обладающих нейропротективными свойствами, позволяющей оценивать уровень ингибирования основных ферментов метаболизма аммиака в мозге: глутаминтрансаминазы К (ГТ-К) и ω-амидазы NIT2 потенциальными соединениями нейропротекторами.
• Изготовлены экспериментальные образцы тест-систем для отбора соединений, обладающих нейропротективными свойствами. Экспериментальные образцы тест-систем были сконструированы на основе 10 образцов ферментативных комплексов ГТ-К и ω-амидазы NIT2 (коммерческих препаратов, ферментов из гомогенатов печени крыс и целевых ферментов, выделенных из трансформантных линий дрожжей Y. lipolytica W29, несущих экспрессионные конструкции pQ-UGT (на основе гена ГТ (CCBL1)) и pQ-UNit (на основе гена ω-амидазы (NM_020202.4; NIT2 человека).
• Разработан проект инструкции по применению аналитической тест-системы, позволяющий реализовывать план исследований по разработке потенциальных нейропротекторов-ингибиторов метаболизма глутамина.
• На животных (аутбредная линия крыс Wistar) разработана экспериментальная модель патогенеза нейродегенеративных заболеваний на основе печёночной энцефалопатии (in vivo).
• Проведена валидация экспериментальной модели и тест-системы (ферментативных комплексов ГТ-К и ω-амидазы NIT2) с использованием набора 5 веществ-блокаторов этих ферментов, обладающих потенциальными нейропротективными свойствами.
• Проведен скрининг химических библиотек соединений, разрешенных для фармацевтического применения в РФ, с целью подбора физиологически безопасных ингибиторов ω-амидазы. На основании анализа литературных данных о структуре активного центра фермента, данных, представленных в белковой базе ProteinDataBank (http://www.rcsb.org) и базе данных химических веществ ChemSpider (http://www.chemspider.com) , проведен докинг 61 кандидатного соединения и отобрано 21 соединение, обладающее высокой энергией связывания с ферментом.
• Проведен скрининг химических библиотек соединений, разрешенных для фармацевтического применения в РФ, с целью подбора физиологически безопасных ингибиторов ГТ-К. На основании анализа литературных данных о структуре активного центра фермента, данных, представленных в белковой базе ProteinDataBank (http://www.rcsb.org) и базе данных химических веществ ChemSpider (http://www.chemspider.com) , проведен докинг 61 кандидатного соединения и отобрано 8 соединений, обладающих высокой энергией связывания с ферментом.

• Разработана экспериментальная модель нейродегенеративных заболеваний на основе определения содержания aКГМ в крови, моче и мозге, имеющая в основе тетрахлорметан- и галактозамин-индуцированную гепатотоксичность. Полученная модель позволила использовать aKГМ в качестве диагностического биомаркера при развитии ПЭ различной этиологии.
• В ходе испытаний ингибиторов ω-амидазы и ГТ-К на животной модели установлено, что действие всех испытанных ингибиторов ГТ-К приводило к частичному снижению содержания aКГМ во всех исследованных биологических образцах мозга и крови. Напротив, ингибиторы ω-амидазы, кроме ГГ, оказывали незначительный эффект на содержание aКГМ в биологических образцах экспериментальных животных. Выполнено обоснование выбора предиктивного диагностического биомаркера для оценки риска развития ПЭ. Ярко выраженные изменения содержания маркерных метаболитов в ходе эксперимента по острой интоксикации отмечены в печени животных. Показано возрастание уровня aKГM в мозге на 5-е и 10-е сутки эксперимента и в плазме крови — на 15-е и 21-е сутки опыта по тетрахлорметан- и галактозамин-индуцированной гепатотоксичности. Данные по уровню aKГM в моче экспериментальных животных с индуцированной ПЭ не показали существенных различий в содержании метаболита.
• Проведен тестовый HPLC-анализ по определению уровней aКГМ в моче пациентов с заболеванием печени, свидетельствующий о том, что:

а) разработанный метод по определению aКГМ в тканях крыс может быть использован для определения уровней aКГМ в моче человека;

б) при существенном разведении приготовленного экстракта мочи, в одной пробе одновременно можно измерять как уровни aКГМ, aКГ и креатинина, к которому концентрация aКГМ и aКГ в моче должны быть нормализованы;

в) проведенный HPLC-анализ способен выявлять низкий уровень нормализованного к креатинину aКГМ в моче здоровых пациентов и в 3-30 раз повышенный уровень aКГМ а моче пациентов с диагностированным заболеванием печени.

• На основании выполненных работ можно утверждать, что уровень aКГМ в биологических жидкостях животных (плазма крови) и человека (моча) может быть использован в качестве предиктивного диагностического биомаркера для оценки риска развития ПЭ. Определение маркерных метаболитов αКГМ и αКГ описанным методом, позволяющим одновременно выявлять оба маркера в одном определении, вполне может быть рекомендовано для использования в рутинной клинической практике.

На 5 этапе проведены следующие работы:

• Разработана методика оценки нейропротективных свойств соединений с использованием разработанной экспериментальной модели, проведены экспериментальные исследования соединений с использованием разработанной экспериментальной модели патогенеза при нейродегенеративных заболеваниях и аналитической тест-системы для отбора соединений, в соответствии с разработанным планом исследований,
• Проведено описание патогенеза нейродегенеративных заболеваний на основе ПЭ, индуцированной D-галактозамином и тетрахлорметаном,
• Разработан проект технического задания на проведение ОТР по теме: «Разработка технологии синтеза и проведение доклинических исследований препарата для лечения ПЭ на основе ингибитора ω-амидазы и глутаминтрансаминазы»,
• Разработаны рекомендации по использованию результатов проведенных ПНИ в реальном секторе экономики,
• Разработаны технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера – организации реального сектора экономики, проведена оценка эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем,
• Выполнена оценка полноты решения задачи и достижения поставленных целей ПНИ,
• Проведены маркетинговые исследования с целью изучения перспектив коммерциализации РИД, полученных при выполнении ПНИ,
• Разработан проект бизнес-плана, проведены дополнительные патентные исследования.
• Обнаружено, что проверенные гепатотоксиканты (тетрахлорметан и D-галактозамин) вызывали тяжелые повреждения печени и внутренних органов экспериментальных животных в эксперименте подострого токсического гепатита (21 сутки введения гепатотоксикантов), о чем свидетельствовали явные морфолого-анатомические изменения внутренних органов – печени и почек животных. Ингибиторы ω-амидазы, вводимые животным опытных групп, получающих тетрахлорметан, не оказывали существенного влияния на патогенез. Ингибиторы ГТ-К, вводимые животным опытных групп, получающих D-галактозамин, смягчали симптоматику гепатита, оказывая выраженное положительное действие на состояние внутренних органов. Анализ гендерных различий позволяет заключить, что самки тяжелее переносили отравление гепатотоксикантами, что выражалось в более интенсивной потере веса и выраженной симптоматике жирового перерождения печени и развития долькового некроза.
• Получены свидетельства гистологической картины токсического гепатита, состоящие в развитии жировых перерождений, гематом, нарушении целостности ткани печени, умеренно элиминируемые при введении ингибиторов ГТ-К. Патологическая картина токсического гепатита в тканях самок визуализировалась более ярко, демонстрируя развитие обширного воспалительного процесса и деградацию тканей печени, что согласовывалось с данными вскрытия, свидетельствующими о развитии жировых перерождений и долькового некроза органа.
• Обнаружены индуцируемые гепатотоксикантами наглядные признаки изменений ткани почек – разрыхление ткани лоханок, нарушение клубочковой структуры, отечность и кровоизлияния. Симптоматика системной патологии была более выражена у самцов, в то время как у самок картина нарушений функции почек включала изменения на клеточном уровне, связанные с деформацией клеток и образованием стопок, не характерных для здоровой ткани. Влияния ингибиторов тест-системы на гистологические параметры почек на фоне развития патологии выявлено не было. Результаты гистологического анализа мозга показали, что по мере продолжительности эксперимента происходило изменение ткани мозга – разрыхление ткани, образование межклеточных полостей (водянка мозга), появление очагов воспаления и гематом. Гендерные различия состояли в том, что у самок наблюдались микрогематомы мозга, в то время как у самцов была более выражена отечность ткани мозга. Влияние ингибиторов существенно не влияло на структуру ткани мозга, за исключением ингибитора 3, который оказывал визуальное уменьшение отечности головного мозга. В заключительной фазе эксперимента обнаружены выраженные изменения биохимических параметров крови животных, получающих гепатотоксиканты — возрастание уровня билирубина, активностей АСТ и АЛТ более чем на 20%. Анализ биохимических показателей крови экспериментальных животных показал, что в группах самцов, получающих ингибиторы ω-амидазы (ингибиторы 1-3) не отмечалось существенных отличий показателей от контрольных значений (референтная группа II), в то время как ингибиторы ГТ-К (ингибиторы 4-6) способствовали изменению показателей крови в сторону контрольных значений (референтная группа I). Проведённые исследования и анализ полученных данных свидетельствуют о том, что αКГМ, уровень которого регулируется работой аналитической тест-системы, вероятнее всего, может являться предиктивным диагностическим биомаркером для оценки степени развития ПЭ.

• Проведены разработка и получение синтетического гена устойчивости к гигромицину, по кодоновому составу и организации старта трансляции адаптированного для экспрессии в митохондриях Y. Lypolytica.
• Получена генетическая конструкция в форме линейной двунитевой ДНК для введения в состав митохондрального генома Y. lipolytica путем гомологичной рекомбинации с 3′-UTR оперона 1.
• Оценена эффективность введения линейной ДНК-конструкции в митохондриальный геном.
• Получены трансформанты дрожжей, несущих генетическую конструкцию в форме линейной двунитевой ДНК в состав митохондрального генома Y. lipolytica.
• Разработан лабораторный регламент получения генетической конструкции для коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF.
• Проведено материально-техническое обеспечение работ этапа.

• Проведена оценка эффективности введения ДНК-конструкции в митохондриальный геном Y. lipolytica в условиях селекции трансформантов по способности к росту на минимальной среде с сукцинатом в качестве единственного субстрата.
• Исследована жизнеспособность рекомбинантных штаммов Y. lipolytica с дефектом в генах Leu-специфичных и Lys-специфичных тРНК, в том числе, при культивировании на минимальной среде с сукцинатом в качестве единственного субстрата.
• Получены генетические конструкции в форме кольцевой ДНК для коррекции митохондриальных мутаций в мезенхимальных стромальных клетках человека путём выделения из клеток дрожжей.
• Получены трансфектанты мезенхимальных стромальных клеток (МСК) человека, несущие геном митохондрий с искусственно восстановленной функцией генов тРНК-Lys и тРНК-Leu.
• Разработаны программа и методика исследовательских испытаний генетической конструкции для коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF.
• Разработаны метод доставки генетической конструкции в митохондрии мезенхимальных стромальных клеток человека и метод оценки эффективности доставки в митохондрии МСК человека, поддерживаемых в культуре in vitro.
• Разработан метод оценки эффективности действия генетической конструкции с точки зрения востановления физиологических функций МСК человека в культуре.

Согласно Плану-графику исполнения обязательств, работа по пятому отчётному периоду ПНИ включала теоретические и экспериментальные исследования в области создания средств коррекции дефектов митохондриального генома человека. В результате были получены следующие основные результаты:

• Проведены исследовательские испытания экспериментальных образцов генетической конструкции для коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF по разработанной программе и методикам.
• Подготовлены предложения и рекомендации по реализации и внедрению результатов ПНИ, в т.ч. обоснование вариантов практического применения разработанных прототипов конструкций.
• Проведена оценка полноты решения задач и достижения поставленных целей ПНИ.
• Проведена технико-экономическая оценка результатов ПНИ.
• Разработан метод количественной оценки уровня стабильности митохондриального генома человека при репликации в клетках Y. lipolytica
• Проведены дополнительные патентные исследования.
• Подготовлены предложения и рекомендации по реализации и внедрению результатов ПНИ.
• Разработаны технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей, и особенностей индустриального партнера.

Сроки выполнения работ по 2 этапу: 01 января 2015 г. – 30 июля 2015 г.

• Сформирован актуальный перечень конкурсов, научных программ ЕС, ведущих исследовательских организаций, в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий для участия российских организаций и исследователей
• Разработаны и размещены на сайте НКТ информационные материалы в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий на первое полугодие 2015 г http://bio-economy.ru/biblioteka/rassylka_bio_nkt/
• Сформирован актуальный перечень программ и проектов Российской Федерации для участия европейских исследователей.
• Сформирована и поддерживается актуальная база европейских исследователей, организаций и фондов в области продовольственных и сельскохозяйственных технологий.
• Разработаны методические указания по развитию навыков подготовки заявок на конкурсы международных программ в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий в 2015-2016 у представителей российского научного сообщества
• Подготовлен аналитический отчет по вопросам практического участия российских исследователей в программе «Горизонт 2020» на основе опыта оказания консультационных услуг за 1 полугодие 2015 года

• Подготовка актуализированных методических и справочных материалов для российских организаций по программе научно-технологического и инновационного развития Евросоюза «Горизонт 2020», в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий, в том числе для размещения на сайте НКТ  в информационно-коммуникационной сети Интернет
• Обобщение практики оказания консультационных услуг российским исследователям по вопросам участия в программе «Горизонт 2020» за 2017 год
• Разработка итоговых информационно-аналитических и справочных материалов по участию Российских организаций в научных программах и проектах Европейского союза и государств-членов ЕС в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий.
• Проведение итогов анализа хода реализации проектов, сформированных при содействии НКТ и профинансированных в рамках международных научно-технических программ.
• Актуализация информации об участии европейских организаций и исследователей в научных программах, фондах и проектах Российской Федерации по результатам 2017 г
• Разработка материалов для проведения в 2017 году мероприятий (информационное дни семинары/вебинары/конференции) по научно-техническому сотрудничеству России с ЕС с участием представителей российских региональных научно-образовательных центров и экспертов ЕС в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий и по приоритетным направлениям развития науки и технологий
• Подготовка предложений по реализации эффективной государственной политики, направленной на развитие сектора исследований и разработок, направленных на совершенствование действующей системы механизмов взаимодействия России и ЕС в научно-техническому и инновационной сферах в рамках поддержки деятельности целевой группы группы TaskForce в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий
• Разработка рекомендации по определению и корректировке научно-технологических приоритетов исследований и разработок
• Обобщение полученных результатов и подготовка информационных и аналитических материалов для участия в совещании НКТ

• Подготовлен аналитический обзор литературы и патентных исследований, свидетельствующий о том, что технология осаждения тяжелых металлов в виде сульфидов при низких значениях рН сообществом ацидофильных сулфатредуцирующих бактерий имеет несомненные перспективы для реализации крупнотоннажного процесса очистки промышленных сточных вод, обогащенных тяжелыми металлами.
• Из двух хвостохранилищ, расположенных в Тисульском районе Кемеровской области были отобраны пробы для последующего метагеномного анализа и выделения сульфатредуцирующих бактерий.
• Проведен химический анализ (содержание анионов и катионов) всех отобранных образцов наддоной воды, поровых вод и донных осадков, а также выделения ДНК для метагеномного анализа структуры микробного сообщества кислых хвостохранилищ.

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 7 августа 2014 № 14.604.21.0108 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014- 2020 годы» на этапе № 2 в период с 30 января 2015г. по 30 июня 2015г.

Выполнялись следующие работы:

• Поиск сульфидогенных микроорганизмов в образцах кислых осадков хвостохранилищ на основе метагеномного анализа.
• Выявление присутствия генов устойчивости к тяжелым металлам у новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов.
• Направленный поиск присутствия штаммов анаэробных сульфидогенных микроорганизмов, обладающих системами антиокислительной защиты.
• Анализ химического состава образующихся сульфидов металлов при культивировании штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов

Были получены следующие результаты:
1. Выполнен поиск сульфидогенных микроорганизмов в образцах кислых осадков хвостохранилищ на основе метагеномного анализа. На основе вариабельного фрагмента гена 16S рибосомной РНК длиной 500 нуклеотидов был проведен таксономический анализ микробного сообщества. Вариабельный фрагмент был амплифицирован с помощью универсальных вырожденных праймеров PRK341F (CCTACGGGRBGCASCAG) и PRK806R (GGACTACYVGGGTATCTAAT). Полученные ПЦР фрагмент очищали и затем проводили его секвенирование с помощью геномного анализатора GS FLX. В результате было получено 137426 независимых нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК. Большинство сульфидогенных бактерий относились к дельта-протеобактериям (Desulfobulbus, Desulfopila, Desulfocapsa, Desulfatirhabdium, Desulfovibrio, Desulfobacca, Desulfomonile) и их суммарная доля составляла около 9%. Также обнаружена вторая группа сульфидогенных бактерий которая относится к филуму Firmicutes и представлена родом Desulfosporosinus. Доля этой группы микроорганизмов составляет около 1%.

2. Выявлено присутствие генов устойчивости к тяжелым металлам у новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов. В геноме Desulfosporosinus sp. I2 присутствовали по меньшей мере два оперона, кодирующие комплекс RND-MFP. Оба оперона (WP_045573056/KJR49082 и WP_045573879/ KJR48138) могут быть связаны с транспортом Co, Cd и Zn и гомологичны паре CzcA/CnrA из C. metallidurans. Кроме того, в геноме Desulfosporosinus sp. I2 также присутствует несколько цинковых/кадмиевых АТРаз. Большинство их них (KJR46488, WP_045575324.1, WP_045576455) характеризовалось высоким уровнем сходства друг с другом и отсутствием у всех Desulfosporosinus за исключением штаммов I2, HMP52 и BICA1-9. Ближайшие гомологи были найдены у различных Clostridium. АТРаза WP_045576455 аннотирована в геноме как гипотетический белок.

3. Проведен направленный поиск присутствия штаммов анаэробных сульфидогенных микроорганизмов, обладающих системами антиокислительной защиты. Были проведены микробиологические и биохимические эксперименты по определению степени влияния кислорода и пероксида водорода (как продукта неполного восстановления О2 в клетках) на рост и процесс сульфатредукции, а также на активность основных ферментов антиокислительной защиты, обуславливающих относительную аэротолерантность СРБ. Было установлено, что выделенная СРБ рода Desulfovibrio является достаточно аэротолерантным микроорганизмом, что позволяет клеткам микроорганизма не только выживать, но и сохранять жизнеспособность в присутствии достаточно высоких концентраций кислорода и продуктов его неполного восстановления (клетки обладали как супероксиддисмутазной, так и пероксидазной активностями). Окислительные стрессы средней интенсивности привели к возрастанию активностей основных ферментов антиокислительной защиты на 15-40%. Анализ генома выделенного штамма Desulfovibrio sp. показал наличие в нем основных генов антиокислительной защиты, характерных для многих СРБ – кодирующих супероксиддисмутазу (sodB), десульфоферродоксин (dfx), рубреритрины (rbr1 и rbr2), рубредоксин-кислород оксидоредуктазу (roo), цитохром d убихинолоксидазу (cydA), цитохром с оксидазу (cox), тиоловую пероксидазу (tpx) и алкилгидропероксидредуктазу (ahp).

4. Был проведен анализ химического состава образующихся сульфидов металлов при культивировании штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов в присутствие повышенных концентраций железа и меди.  Основными минералами, обнаруженными в осадке, были ковеллит, CuS, макинавит, FeS, и вивианит Fe3(PO4)2×8H2O.

В ходе выполнения проекта на этапе № 3 в период с 1 июля 2015г. по 31 декабря 2015г. были выполнены следующие работы:

• Была разработана лабораторная, которая относится к способам выделения чистых культур ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов, устойчивых к низким значениям рН и высоким концентрациям ионов металлов из отходов добычи сульфидных руд.
• Были проведены работы по выделению накопительных культур ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов. Выделение накопительных культур проводили согласно разработанной методике выделения. Были получены сульфидогенные накопительные культуры из проб кислых осадков на лактате и этаноле, на пептоне и формиате, способные к росту при начальных низких значениях рН среды 2.5 и перспективные для проведения дальнейших исследований. Состав культур был исследован с помощью ДГГЭ фрагментов генов 16S рРНК. В пробах были обнаружены филотипы, принадлежащие к таким родам СРБ как Desulfosporosinus, Desulfotomaculum и Desulfovibrio.
• Проведены работы по выделению чистых культур ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов. Чистые культуры выделяли методом предельных разведений из полученных ранее накопительных культур. После получения морфологически однородных культур проводили анализ близкой к полной последовательности гена 16S рРНК. В результате удалось выделить и идентифицировать две стабильно растущих при низких рН чистых культуры СРБ, которые были отобраны для проведения дальнейших работ: Desulfovibrio sp. OI и Desulfosporosinus sp. OL
• Проведено культивирование выделенных штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов в условиях низких значений  рН и высокого содержания ионов металлов (Сu, Zn). Для изучения устойчивости выделенных новых штаммов ацидофильных СРБ к ионам тяжелых металлов и определения предельных для роста концентраций проводили культивирование с добавлением ионов таких металлов, как медь (Cu2+), кадмий (Cd2+), никель (Ni2+) и кобальт (Co2+). Проведенные работы по культивированию выделенных новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов Desulfovibrio sp. OI и Desulfosporosinus sp. OL в присутствии ионов металлов позволили выявить устойчивость к высоким концентрациям ионам меди, никеля, кобальта и кадмия в условиях низких значений рН (4,0) и определить предельные для роста концентрации. Штаммы Desulfovibrio sp. OI и Desulfosporosinus sp. OL были способны расти при концентрациях в среде (мг/л) Cu2+ 100 и 300, Ni2+ — 150 и 300, Co2+ 150 и 150, Cd2+ 10 и 15, соответственно.
• 5.  Была проверена устойчивость выделенных штаммов к окислительному стрессу. Выделенные штаммы Desulfovibrio sp. OI и Desulfovibrio sp. O1 были способны к слабому росту на агаризованной питательной среде Постгейта С в условиях аэробиоза и поэтому могут считаться аэротолератными. Были проведены микробиологические и биохимические эксперименты по определению степени влияния кислорода и пероксида водорода (как продукта неполного восстановления О2 в клетках) на рост и процесс сульфатредукции, а также по измерению активностей основных ферментов антиокислительной защиты (каталазы, пероксидазы, супероксиддисмутазы/супероксидредуктазы), обуславливающих относительную аэротолерантность СРБ. Было установлено, что штаммы Desulfovibrio sp. OI и Desulfovibrio sp. O1 были активны при концентрации O2 в газовой фазе до 3 и 5%, при концентрации H2O2 до 0,1 и 0,5 мМ, соответственно. Биохимические исследования показали наличие у исследованных штаммов Desulfovibrio sp. OI и Desulfovibrio sp. O1 супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы и каталазы, соответственно.
• Было изучено образование сульфидных минералов СРБ. Для изучения процесса образования нерастворимых сульфидов штаммами OI и OL культивирование проводили на среде с лактатом при добавлении к основной среде раствора ионов никеля и кобальта в концентрации 200 мг/л  при рН 4,5 и 3,5, соответственно. Было обнаружено, что в процессе сульфатредукции образуются такие минералы как лепидокрокит (FeO(OH)), вивианит (Fe3(PO4)2×8H2O), кристаллическая сера (S8), кобальтпентландит (Co9S8), пентландит (Fe6Ni3S8).    .
• В соответствии с ТЗ, предусматривающем депонирование выделенных в ходе ПНИ штаммов СРБ были подготовлена заявка на депонирование штамма Desulfosporosinus sp. OL1 и штамма Desolfovibrio sp. OI1 во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (ИБФМ). К заявке на депонирование были составлены  паспорта депонируемых штаммов, в которых были приведены сведения о физиологических свойствах штамма, условиях культивирования и таксономическом положении. В коллекции штаммам были присвоены регистрационные номера ВКМ В-3021 D (Desulfosporosinus sp. OL1) и ВКМ В-3020 D (Desolfovibrio sp. OI1). Заявки на депонирование и паспорт штамма представлены в виде отдельных документов к отчету.
• Были провдены эксперименты по культивированию штамма Desulfovibrio sp. OI в непрерывном проточном режиме, и выявлены наибольшие значения ростовых параметров при значениях рН 5,0-5,3. Снижение рН в условиях биореактора ниже 5,0 ингибировало рост культуры, хотя в режиме периодического культивирования наблюдали хороший рост культуры при рН ниже 5,0 вплоть до 3,5. Эксперименты по оптимизации условий культивирования в биореакторе при низких значениях рН будут продолжены на последующих этапах выполнения работ.
• Были проведены дополнительные патентные исследования и подготовка заявки на получение патента. Проведенные патентные исследования позволили выявить ближайшие аналоги полученных в ходе выполнения ПНИ  результатов и сформулировать объект правовой защиты – заявку на изобретение «Ацидофильный штамм Desulfosporosinus sp. OL для очистки загрязненных экосистем с экстремально кислыми значениями рH».

В ходе выполнения проекта на этапе № 4 в период с 1 января 2016г. по 30 июня 2016г. были выполнены следующие работы:

• Выбор наиболее активных штаммов среди выделенных ацидофильных микроорганизмов и выделение клеточной ДНК.
  Для проведения анализа полного генома были выбраны выделенные из кислых отходов добычи металлов чистые культуры СРБ Desulfosporosinus sp. I2 и Desulfosporosinus sp. OL, характеризующиеся наиболее высокой устойчивостью к меди и ацидофильным ростом.
  Чистота культур полученных новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов, выбранных для геномного анализа, была подтверждена современными методами генетического, биохимического и микроскопического анализов, что соответствует п. 4.2.3 ТЗ.
  Выбранные штаммы восстанавливают сульфат с образованием сероводорода при начальном рН среды 2,5, устойчивы к концентрациям кислорода в газовой фазе не менее 0,02 % и обладают устойчивостью к ионам меди, никеля, кобальта и кадмия в повышенных концентрациях, суммарно превышающих 500 мг/л, что соответствует п. 4.2.2 ТЗ. Характеристика устойчивости новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микрооорганизмов к суммарной концентрации металлов не менее 500 мг/л и начальной рН среды не выше 2.5 подтверждена в серии экспериментов, включающей не менее 5 субкультивирований, что соответствует пп. 4.2.2 и 4.2.5 ТЗ.
  ДНК штаммов I2 и OL была выделена с помощью лизиса с SDS и протеиназой К и экстракцией смесью фенол : хлороформ. Полученного количества ДНК достаточно для проведения полногеномного секвенирования (минимально необходимое количество – 1 мкг).
• Секвенирование и анализ полных геномов биотехнологически перспективных штаммов ацидофильных сульфидогенных микрорганизмов.
  В результате пиросеквенирования и сборки драфт-генома Desulfosporosinus sp. I2  получено 318 контигов длиной более 500 п.о. с размером контига N50 в 30483 п.о.  Аннотация последовательности генома показала 5512 потенциальных белок-кодирующих генов, из которых 3987 (72 %) могут быть функционально значимыми. Геном аннотирован в базу данных референсных последовательностей (RefSeq) NCBI под номером NZ_JYNH00000000.1.
  В результате пиросеквенирования и сборки генома Desulfosporosinus sp. OL  получено 290 контигов длиной более 500 нт. Размер генома, оцененный как общая длина всех контигов, составляет около 4.9 млн. нт. Были определены оперон 16S-23S-5S рРНК и 47 генов тРНК, кодирующих все 20 аминокислот. Аннотация последовательности генома выявили 5871 потенциальных белок-кодирующих генов, для 3934 (67 %) из которых  могут быть предсказаны функции. Проект по секвенированию генома штамма Desulfosporosinus sp. OL зарегистрирован в базе данных NCBI под номером PRJNA338386.
  Таким образом, в соответствии с п. 3.8 ТЗ определены нуклеотидные последовательности геномов новых двух штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов — Desulfosporosinus sp. I2 и Desulfosporosinus sp. OL. Полученный геном Desulfosporosinus sp. I2 состоит из 318 контигов длиной более 500 п.о., с общей длиной 5311733 п.о.  Размер генома, оцененный как общая длина всех контигов, составляет около 5,31 Мбит, а содержание GC-пар в геноме — 42,4 %. Были определены пять копий оперона 16S-23S-5S рРНК и 43 гена тРНК, кодирующих все 20 аминокислот. Аннотация последовательности генома показала 5512 потенциальных белок-кодирующих генов, для 3987 (72 %) из которых  могут быть предсказаны функции.
• Поиск в геноме генетических кластеров, ответственных за устойчивость выделенных штаммов ацидофильных сульфидогенных микрорганизмов к высоким концентрациям солей металлов (Сu, Zn), низким значениям рН, а также окислительному стрессу.
  В аннотированном геноме ацидофильной устойчивой к высоким концентрациям СРБ Desulfosporosinus sp. I2 проведен поиск генетических кластеров, ответственных за устойчивость штамма к высоким концентрациям солей металлов, низким значениям рН, а также окислительному стрессу. Устойчивость к металлам обусловлена присутствием в геноме АТФаз П-типа (транспортирующих Cu2+ и Ag2+, а также Zn2+, Cd2+, и Pb2+),  RND (Resistance-Nodulation-Division) транспортеров и белков семейства CDF (cation diffusion facilitators), участвующих в диффузии катионов. Обнаруженные в геноме штамма I2 системы детоксикации кислорода представлены генами супероксиддисмутазы и каталазы, а также окисдоредуктазы. Устойчивость к низким рН связана с присутствием в геноме K+-транспортирующих белков KtrB и TrkA, а также протон-потребляющих декарбоксилаз, таких как аргинин декарбоксилаза Adia и лизин декарбоксилаза CadA.
• Проведение химического анализа биогенного осадка, образованного в процессе культивирования штаммов сульфидогенных микроорганизмов.
  В ходе проведенных работ по культивированию штамма I2 с добавлением ионов меди в концентрации 100 мг/л получены биогенные осадки разных сроков культивирования (16, 28 и 77 сут.). Проведенный элементный и минералогический анализ показал присутствие на всех сроках культивирования, начиная с 16 сут кристаллических фаз сульфидов меди, таких как ковеллин и халькопирит. Трансмиссионная электронная микроскопия ультратонких срезов клеток показала присутствие микрочастиц сульфидов на поверхности клеточной стенки через 16 суток культивирования. При более продолжительных сроках культивирования наблюдали скопления свободных микрочастиц.
• Проведение дополнительных патентных исследований и подготовка заявки на получение патента.
  Проведенные патентные исследования позволили выявить ближайшие аналоги и сформулировать объект правовой защиты – заявку на изобретение «СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ШАХТНЫХ ВОД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК». В ходе проведения работ экспериментальных исследований, предусмотренных ТЗ, и проведения патентных исследований было показано, что данный способ позволяет провести подготовку проб для последующего эффективного выделения ДНК из проб кислых сточных вод и осадков для проведения молекулярно-биологических исследовании для выявления штаммов перспективных для использования в различных биотехнологических процессах.

Согласно плану-графику исполнения обязательств, на четвертом этапе ПНИ Индустриальным партнером должны были быть проведены следующие работы «Проведение маркетинговых исследований с целью изучения перспектив коммерциализации РИД» и «Разработка лабораторного технологического регламента извлечения сульфидов металлов (Сu, Zn) с помощью новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов». В связи со сменой Индустриального партнера данные работы будут выполнены на 5 этапе в полном объеме.

В ходе выполнения проекта на этапе № 5 в период с 1 июля 2016г. по 31 декабря 2016 г. были получены следующие результаты:

• Исследования по извлечению сульфидов металлов (Сu, Zn) из отходов горнодобывающей промышленности с помощью новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов.
  Были проведены исследования по извлечению сульфидов металлов (Cu, Zn) из отходов горнодобывающей промышленности с помощью бинарной культуры сульфидогенных  штаммов Desulfosporosinus sp. OL и Desulfovibrio sp. OI, устойчивых к низким рН среды и высоким концентрациям растворенных металлов. Эксперимент проведен с использованием биореактора, где проходило культивирование штаммов и куда в полупериодическом режиме поступали жидкие отходы хвостохранилища (рН 2,2), содержащие растворенные металлы, включая медь (не менее 200 мг/л) и цинк (не менее 200 мг/л). Собранный нерастворимый осадок, образовавшийся в ходе культивирования в течение 14 суток с поступлением в проток содержащей металлы жидких отходов хвостохранилища, содержал кристаллические фазы сульфидов меди, таких как ярровит (Cu9S8) и орикит ((CuFeS2)xH2O
• Обобщение результатов исследований.
  Обобщение результатов исследований показало, что выполненные работы и их результаты соответствовали заявленным  целям и задачам ПНИ.
• Сопоставление теоретических и экспериментальных исследований.
  Сопоставление теоретических и экспериментальных исследований показало, что сделанные на основании теоретических исследований обоснование и выбор направления исследований позволили достичь необходимых для достижения целей ПНИ результатов. Выделение СРБ из осадков хвостохранилищ позволило выделить штаммы СРБ с требуемыми свойствами и провести технологические исследования по осаждению сульфидов металлов из отходов горнодобывающей промышленности (кислых сточных вод) с помощью новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов.
• Оценка полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем
  Оценка полученных в ходе выполнения ПНИ результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем показало, что полученные результаты могут быть использованы для усовершенствования существующих технологических схем активной очистки кислых сточных вод от сульфатов и ионов тяжелых металлов.
• Разработка технических требований использования микробиологической технологии одностадийного извлечения металлов.
  Разработанные технические требования распространяются на микробиологические технологии одностадийного извлечения металлов, предназначенные для извлечения металлов из сточных вод отходов цветной металлургии в виде сульфидов, образующихся в процессе роста штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов. Разработанные технические требования включают разделы «Предисловие»,  «Область применения», «Нормативные ссылки», «Термины и определения», «Основные технические требования», «Требования к используемым штаммам». Разработанные технические требования представлены в виде отдельного документа (приложения к отчету).
• Разработка проекта ТЗ на проведение ОТР.
  В соответствии с Техническим заданием и План-графиком на заключительном этапе по результатам выполненного проекта запланирована разработка Технического задания на проведение опытно-технологической работы (ОТР) по теме «Разработка технологии одностадийного образования сульфидов металлов с использованием сульфидогенных микроорганизмов».
• Материально-техническое обеспечение работ.
• Адаптация новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов для непрерывного культивирования в условиях опытно-промышленных установок.
  Проведенные работы адаптация новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов для непрерывного культивирования в условиях опытно-промышленных установок показали, что бинарная культура, состоящая из выделенных в ходе выполнения ПНИ штаммы ацидофильных СРБ (Desulfosporosinus sp.OL и Desulfovibrio sp. OI,) могут быть успешно адаптированы для культивирования в условиях биореактора.

Кроме того, были выполнены работы, перенесенные из 4 этапа на 5 в связи со сменой Индустриального партнера:

• Проведение маркетинговых исследований с целью изучения перспектив коммерциализации РИД.
  Были проведены маркетинговые исследования с целью определения востребованности результатов ПНИ потенциальными потребителями на территории России и возможности их коммерциализации. Был проведен сравнительный анализ технологий очистки рудничных вод от сульфатов и металлов, сведений о мировом опыте внедрения данных технологий. Проведен анализ объемов инвестиций компаний ГМК России и государственного бюджета РФ в охрану окружающей среды. Было установлено, что технологии активной биологической очистки кислых стоков от сульфатов и тяжелых металлов с использованием результатов ПНИ могут быть востребованы предприятиями ГМК России.
• Разработка лабораторного технологического регламента извлечения сульфидов металлов (Сu, Zn) с помощью новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов. Разработанный технологический регламент предусматривает получение сульфидов металлов с помощью штаммов, выделенных в процессе выполнения ПНИ в режиме проточного культивирования.

• подготовлен аналитический обзор литературы и патентных исследований, свидетельствующий о том, что технология аноксидного окисления аммония, осуществляемая специфической группой бактерий – планктомицетов, имеет несомненные перспективы для реализации крупнотоннажного процесса Анаммокс на очистных сооружениях г. Москвы и других крупных городах РФ.
• На примере монокультур анаммокс бактерий, имеющихся в ИНМИ РАН, а также микробных сообществ из осадочных отложений действующих очистных сооружений г. Москвы проведена отработка методов для анализа консорциума микроорганизмов, осуществляющих процесс Анаммокс.
• С помощью параллельного пиросеквенирования фрагментов генов 16S РНК проведен молекулярный анализ 6 образцов консорциума микроорганизмов из очистных сооружений, соответствующих трем последовательным этапам селекции.
• Определены динамика изменения соотношения основных групп микроорганизмов по мере «созревания» ила, а также их распределение между нитрифицирующей и анаммокс фракциями. Среди нитрифицирующих бактерий обнаружены представители Nitrospira и протеобактерий.
• Разработана техническая документация на однореакторную лабораторную установки анаммокс и проводится закупка необходимого оборудования для ее монтажа.

В ходе выполнения проекта на этапе № 2 в период с 30 января 2015г. по 30 июня 2015г. выполнялись следующие работы:

• Запуск однореакторной лабораторной установки анаммокс.
• Подбор условий и параметров культивирования активного ила анаммокс в однореакторной лабораторной установке анаммокс.
• Наработка экспериментального образца активного ила анаммокс.
• Разработка программы и методик исследовательских испытаний экспериментального образца активного ила анаммокс.
• Определение состава микробного консорциума экспериментального образца активного ила анаммокс молекулярными методами.
• Разработка программы и методик исследовательских испытаний однореакторной лабораторной установки анаммокс.
• Разработка инструкции по эксплуатации однореакторной лабораторной установки анаммокс.
• Разработка технической документации на однореакторную пилотную установку анаммокс.
• Материально-техническое обеспечение работ по запуску пилотной установки анаммокс.
• Контроль за эффективностью работы однореакторной лабораторной установки анамммокс по удалению азота из сточных вод.

Получены следующие результаты:

• Разработана техническая документация на однореакторную лабораторную установку анаммокс, состоящую из пояснительной записки, чертежа общего вида, маршрутных карт и технологической схемы. Разработана инструкция по эксплуатации однореакторной лабораторной установки анаммокс. Осуществлен монтаж, сборка и запуск на территории АО «Мосводоканал» однореакторной лабораторной установки анаммокс, очищающей не менее 100 л сточных вод в сутки.   Для инокуляции был использован ил из ферментера анаммокс, работавшего при температуре 30оС. В результате подбора оптимальных условий и параметров культивирования активного ила анаммокс в однореакторной лабораторной установке анаммокс был наработан экспериментальный образец активного ила анаммокс для дальнейших исследовательских испытаний.  Разработана техническая документация на однореакторную пилотную установку анаммокс, состоящая из пояснительной записки, чертежа общего вида, маршрутных карт и технологической схемы.
• Полученные характеристики научной продукции, свойств активного ила анаммокс и лабораторной установки анаммокс, подтверждают правильность выбранного пути создания первой российской импортозамещающей технологии очистки сточных вод от аммония Анаммокс. Успешно осуществлена инокуляция активного ила анаммокс и его наращивание. Технология отличается от зарубежных аналогов новизной технических решений – использованием прикрепленной загрузки (за рубежом используются в основном технологии на основе свободного ила и плавающих загрузок), а также простотой алгоритма управления. Микроорганизмы, ведущие процесс анаммокс в установке Jettenia moscovienalis, впервые выделены, т.е. не встречаются нигде более в мире, что открывает перспективы патентования. Полученные результаты полностью соответствуют требованиям технического задания.

В ходе выполнения проекта на этапе № 3 в период с 1 июля 2015г. по 31 декабря 2015г. выполнялись следующие работы:

• Проведение исследовательских испытаний экспериментального образца активного ила анаммокс, наработанного в однореакторной лабораторной установке анамокс
• Метагеномный анализ консорциума микроорганизмов экспериментального образца активного ила анаммокс
• Сборка и запуск пилотной однореакторной установки анаммокс.
• Разработка Программы и методик исследовательских испытаний однореакторной пилотной установки анаммокс
• Проведение исследовательских испытаний однореакторной лабораторной установки анаммокс.
• Материально-техническое обеспечение работ по обслуживанию однореакторной лабораторной и пилотной установок анаммокс.
• Контроль за эффективностью работы однореакторной лабораторной и пилотной установок анамммокс по удалению азота из сточных вод.
• Разработка инструкции по эксплуатации однореакторной пилотной установки анаммокс.

Были получены следующие результаты:

• Успешно проведены исследовательские испытания экспериментального образца активного ила анаммокс, наработанного в однореакторной лабораторной установке анаммокс по всем пунктам Программы и методикам исследовательских испытаний. В однореакторной лабораторной установке постоянно присутствуют в физиологически активном состоянии как минимум два вида анаммокс-бактерий Ca. “Brocadia” sp. и Ca. “Jettenia moscovienalis”, процентное соотношение которых изменяется в ответ на изменения внешних условий. Суммарная численность физиологически активных нитрификаторов II группы была низкой (менее 1.5% от общей численности эубактерий). Вклад нитрификаторов I группы составлял 30-35% от общей численности эубактерий, что коррелировало с численностью анаммокс-бактерий и обеспечивало высокую эффективность удаления аммония в лабораторной установке. После увеличения содержания аммонийного азота в поступающем на очистку фильтрате и оптимизации параметров работы лабораторной установки эффективность удаления азота достигла 80%. Температурный оптимум роста микробного сообщества, осуществляющего эффективное удаление аммонийного азота, лежит в диапазоне температур 25-37оС. Оптимальный рН роста микробного сообщества лежит в диапазоне рН 6.5 – 8.5.
• В результате анализа метагеномных данных было установлено, что в активном иле анаммокс формируется сложное сбалансированное микробное сообщество, в котором доминирующим микроорганизмом является ранее не описанная бактерия рода Ca “Brocadia”, близкородственная Ca. “Brocadia caroliniensis” (98% сходства последовательностей гена 16S рРНК).
• В соответствии с пп. 2.6, 3.17, 4.1.4, 4.1.5, 4.1.6, 4.2 ТЗ на третьем этапе выполнения ПНИ была собрана и запущена пилотная однореакторная установка анаммокс.
• Объект испытания однореакторная лабораторная установка анаммокс выдержал испытание по пунктам № 4.1-4.7 и 6.1-6.7 Программы и методики исследовательских испытаний однореакторной лабораторной установки анаммокс (ИИ 14.607.21.0018 ЛУА). Объект испытания однореакторная лабораторная установка анаммокс, соответствует техническим требованиям пунктов № 4.1.1-4.1.3 ТЗ.

В ходе выполнения проекта на этапе № 4 в период с 1 января 2016г. по 30 декабря 2016г. выполнялись следующие работы:

• Микробиологический и физиолого-биохимический контроль изменения активности микроорганизмов экспериментального образца активного ила анаммокс.
• Молекулярный анализ стабильности состава консорциума экспериментального образца активного активного ила в ходе биотехнологического процесса.
• Наработка в пилотной установке экспериментального образца активного ила анаммокс для инокуляции промышленного биореактора.
• Проведение исследовательских испытаний однореакторной пилотной установки анаммокс.
• Материально-техническое обеспечение работ по обслуживанию однореакторной пилотной установки анаммокс.
• Контроль количества и качества экспериментального образца активного ила анаммокс в однореакторной пилотной установке анаммокс.

Были получены следующие результаты:

• Осуществлен микробиологический и физиолого-биохимический контроль изменения активности микроорганизмов экспериментального образца АИ анаммокс, в результате которого показано, что скорость роста анаммокс-бактерий в экспериментальном образце АИ пилотной установки составляет 0.11 сут-1, что соответствует времени удвоения менее 10 сут, и выше запланированного показателя (20-30 сут). Выращенный в пилотной установке АИ анаммокс гетерогенен по составу анаммокс-популяции и демонстрирует чрезвычайно высокую устойчивость к повышенным концентрациям нитритов (100-300 мг/л). В разные периоды работы установки в АИ присутствуют в физиологически активном состоянии как минимум три морфотипа анаммокс-бактерий с разным отношением к нитриту: растущие при концентрациях нитрита 130 мг/л и ниже, растущие в широком диапазоне концентраций нитритов (130-300 мг/л), но предпочитающие более низкие концентрации и 3) растущие при высоких концентрациях нитрита (300 мг/л).
• Проведен молекулярный анализ стабильности состава консорциума экспериментального образца АИ анаммокс в ходе биотехнологического процесса, в результате которого показано, что таксономическое разнообразие бактерий увеличивается в ходе технологического процесса при общем снижении вклада филумов, доминировавших ранее в лабораторной установке и попавших в пилотную установку с инокулятом. Данная тенденция прослеживается и по отношению к целевому порядку Planctomycetes. Напротив, разнообразие архей в АИ пилотной установки снижается по сравнению с инокулятом, но сохраняется доминирование ацетокластических метаногенов. В ходе технологического процесса в АИ пилотной установки снизился общий вклад планктомицетов по сравнению с инокулятом за счет снижения доли анаммокс-бактерий. Возможной причиной этого является возрастание содержания нитритов в реакторе. Данные, полученные с помощью метода пиросеквенирования, согласуются с результатами физиолого-биохимического и микроскопического контроля АИ и позволяют с высокой долей вероятности утверждать, что анаммокс-бактерии Ca. “Brocadia” sp. обладают важным технологическим свойством – активностью при высоких концентрациях нитрита (более 250 мг N/л), а Ca. “Anammoxoglobus” — при низких.
• В пилотной установке наработан экспериментальный образец АИ анаммокс для инокуляции промышленного биореактора в количестве 1 шт. массой 20 кг (объем АИ — 2 м3, доза ила — 10 кг/м3). Комиссией установлено, что объект испытаний пригоден для инокуляции промышленного биореактора.
• Проведены исследовательские испытания однореакторной пилотной установки анаммокс по ранее разработанным Программе и методикам, в результате которых выявлены основные показатели работы однореакторной пилотной установки анаммокс: мощность по расходу фильтрата – 10-20 м3/сут, мощность по удалению азота — 2-3 кг азота в сутки, эффективность удаления азота – до 90%. Таким образом, требования ТЗ к объекту испытаний — однореакторной пилотной установке анаммокс — выполнены в полном объеме, объект испытаний и техническая документация на объект испытаний в техническом и патентно-правовом аспекте соответствует заданным в техническом задании требованиям, перечисленным в Программе и методиках.
• Из средств Индустриального партнера АО «Мосводоканал» были выполнены в полном объеме заявленные в плане-графике работы: материально-техническое обеспечение работ по обслуживанию однореакторной пилотной установки анаммокс и контроль количества и качества экспериментального образца активного ила анаммокс в однореакторной пилотной установке анаммокс. Кроме того, было профинансировано участие в конгрессе Экватек-2016.
• Осуществлен контроль количества и качества экспериментального образца активного ила анаммокс в однореактоной пилотной установке анаммокс, в результате которого показано, что к концу отчетного периода (конец июня 2016 г) был успешно завершен период технологической пуско-наладки, отлажено все технологическое оборудование (емкостное оборудование, трубопроводы, механическое оборудование, электрооборудование, система автоматизации, сбора и обработки данных), установка вышла на запланированную мощность по расходу фильтрата и удалению азота. Об адаптации биоценоза АИ (прикрепленного и свободноплавающего) к условиям установки свидетельствует возрастание количества (массы) ила, начавшееся спустя 2-2,5 мес с момента инокуляции пилотной установки. Подтверждена возможность использования электропроводности среды для контроля как эффективности удаления азота в ходе работы установки, так и для расчетов концентрации аммония в поступающем фильтрате и в очищенной воде.

На четвертом этапе выполнения ПНИ написаны и сданы в печать две экспериментальные статьи по результатам экспериментальных испытаний однореакторной лабораторной установки анаммокс, полученным на 3 этапе выполнения ПНИ:
1.   Марданов А.В., Белецкий А.В., Каллистова А.Ю., Котляров Р.Ю, Николаев Ю.А., Кевбрина М.В., Агарев А.М., Равин Н.В., Пименов Н.В. Динамика изменения состава микробного консорциума в процессе запуска однореакторной проточной лабораторной установки нитритации/анаммокс // Микробиология. 2016. Принята к печати и будет опубликована в №6 журнала.
2.   А.Г. Дорофеев, Ю.А. Николаев, М.Н. Козлов, М.В. Кевбрина, А.М. Агарев, А.Ю. Каллистова, Н.В. Пименов. Математическое моделирование процесса анаммокс с использованием пакета прикладных программ BioWin // Прикладная биохимия и микробиология. Сдана в печать 23.05.16.

Результаты работы были представлены на конгрессе Экватек-2016, проходившем в Москве с 26 по 28 апреля 2016 г. в виде устного доклада и статьи, опубликованной в материалах конгресса:
1. Козлов М.Н., Кевбрина М.В., Николаев Ю.А., Дорофеев А.Г., Асеева В.Г., Грачев В.А., Жарков А.В., Пименов Н.В. Развитие технологии аноксидного окисления аммония для очистки сточных вод в АО «Мосводоканал».

В ходе выполнения проекта на этапе № 5 в период с 1 июля 2016г. по 31 декабря 2016г. были выполнены следующие работы:

• Произведена оптимизация параметров экспериментального образца активного ила анаммокс для инокуляции промышленного биореактора, в результате которой получен активный ил, содержащий уникальный консорциум анаммокс-бактерий, который не только полностью соответствует параметрам п. 4.1.8 ТЗ, но и содержит новые организмы: анаммокс-бактерий, устойчивых к высоким концентрациям нитритов и низким значениям рН, и термотолерантных бактерий-нитрификаторов первой группы Высокая скорость роста анаммокс-бактерий позволяет усовершенствовать технологию за счет накопления биомассы анаммокс-бактерий в свободноплавающем иле. В пилотной установке накоплено. В пилотной установке анаммокс наработано 277 кг экспериментального образца активного ила анаммокс для инокуляции промышленного биореактора.
• Проведено технико-экономическое обоснование применения технологии анаммокс на ЛОС, которое подтверждает перспективность внедрения технологии Анаммокс на ЛОС и других очистных сооружениях: экономический эффект от внедрения технологии Анаммокс на ЛОС составит 120 млн. рублей в год, капитальные затраты для строительства цеха Анаммокс для очистки фильтрата декантеров составят 553 млн. руб, срок окупаемости — 4.6 года.
• Разработано ТЗ на проведение ОТР по теме «Разработка технологии аноксидного окисления анаммокс на Люберецких очистных сооружениях».
• Разработаны рекомендации по эксплуатации промышленного реактора анаммокс на Люберецких очистных сооружениях.
• Из средств Индустриального партнера АО «Мосводоканал» были выполнены в полном объеме заявленные в плане-графике работы: материально-техническое обеспечение работ по разработке рекомендаций по эксплуатации промышленного реактора анаммокс на ЛОС, по обслуживанию однореакторной пилотной установки анаммокс и контролю количества и качества экспериментального образца активного ила анаммокс, по разработке задания на проектирование промышленного биореактора анаммокс на ЛОС.
• Разработано задание на проектирование промышленного биореактора анаммокс на ЛОС.
• На пятом этапе выполнения ПНИ опубликована статья, индексируемая в WoS и Scopus:

Марданов А.В., Белецкий А.В., Каллистова А.Ю., Котляров Р.Ю., Николаев Ю.А., Кевбрина М.В., Агарев А.М., Равин Н.В., Пименов Н.В. Динамика изменения состава микробного консорциума в процессе запуска однореакторной проточной лабораторной установки нитритации/анаммокс // Микробиология. 2016. Т. 85. №6. C. 663-675.

Принята к печати и будет опубликована в январе 2017 г статья:
Дорофеев А.Г., Николаев Ю.А., Козлов М.Н., Кевбрина М.В., Агарев А.М., Каллистова А.Ю., Пименов Н.В. Моделирование процесса анаммокс с использованием пакета прикладных программ BioWin // Прикладная биохимия и микробиология. 2017, Т. 53. №1, Сдана в редакцию 19.05.2016 г.

• Результаты работы были представлены в виде устных докладов на:
  1. Международной научно-практической конференции «Водный форум БРИКС», Россия, Москва, 29-30 сентября 2016 г.,
  2. V Съезде биохимиков России, Сочи, Россия, 4-8 октября 2016 г.,
  3. III ежегодной Всероссийской Научно-практической конференции «Исследования и разработки — 2016», Россия, Москва, 14-15 декабря 2016 г.
• По результатам работы получен патент РФ на изобретение № 2605325 (решение о выдаче патента от 28.10.2016 г.) по заявке № 2015142067 «Способ очистки сточных вод от аммония и органического вещества», авторы: Козлов М.Н., Гаврилин А.М., Кевбрина М.В., Николаев Ю.А., Дорофеев А.Г., Пименов Н.В., Агарев А.М., Каллистова А.Ю., патентообладатель — ФИЦ Биотехнологии РАН.
• Подана заявка на изобретение «Способ очистки сточных вод от аммония и органического вещества и установка для его осуществления» № 2016144486, авторы: Козлов М.Н., Гаврилин А.М., Кевбрина М.В., Николаев Ю.А., Дорофеев А.Г., Пименов Н.В., Жарков А.В., Агарев А.М., Асеева В.Г., Каллистова А.Ю., дата поступления заявки в ФИПС — 14.11.2016, патентообладатель — ФИЦ Биотехнологии РАН.

Работа на первом этапе была направлена на выбор решений, лежащих в основе новой технологии промышленного получения вирусоподобных частиц. Технология должна быть экономически оправданной, обладать простотой и высокой технологической устойчивостью, обеспечивать повышение иммуногенности антигена по сравнению с его растворимой формой, сопоставимое с иммуногенностью природных вирусных частиц.

На первом этапе работы были получены результаты:

• За счет анализа научных публикаций и патентной литературы выявлены тенденции, характеризующие область объекта разработки: получение вакцин для специфической профилактики сибиреязвенной инфекции у человека и животных, использование вирусоподобных частиц при создании вакцин.
• Сконструирован искусственный ген протективного антигена B.anthracis, адаптированный по кодоновому составу для экспрессии в E. coli. С помощью искусственного гена PAG получена экспрессионная конструкция на оcнове вектора pQE
• Разработан дизайн экспрессионной конструкции, кодирующей слитой продукт «pb10 DT57 1/2 — PAG» (с использованием протективного декорирующего белка головки бактериофага pb10 DT57 1/2 и протективного антигена B.anthracis).
• Создана коллекция бактериофагов для отбора белков, позволяющих наиболее эффективно конструировать на их основе ВПЧ с высокой иммуногенностью и оптимальными технологическими свойствами.

Работа по 2 этапу была направлена на cоздание рекомбинантных штаммов-продуцентов модифицированного протективного антигена B. anthracis в форме частиц бактериофагов. Получаемые на данном этапе генно-инженерные конструкции должны обеспечивать продукцию двух интактных бактериофагов и одного химерного белка, включающего полимеризующийся белок бактериофага и целевой антиген в клетках E.coli.

В течение отчетного периода работы были получены следующие наиболее важные результаты:

• В результате скрининга созданной на предыдущем этапе коллекции бактериофагов отобраны два новых, патентно-чистых бактериофага, пригодных для использования в целях развития создаваемой технологии в качестве векторов для дисплея антигенов и источников генов полимеризующихся белков.
• Созданы экспрессионные плазмидные конструкции, обеспечивающие продукцию в клетках E. coli белка трубки хвоста pb6 и белка, терминирующего хвост p142 бактериофага DT57C под контролем промоторов фага Т7.
• Создана экспрессионная плазмидная конструкция, обеспечивающая экспрессию химерного белка, содержащего на N-конце полную последовательность полимеризующегося белка p142, а на С-конце антигена — PA20 Bacillus anthracis, соединенных гибким линкером.
• Отработаны условия культивирования полученных продуцентов, обеспечивающие оптимальную экспрессию полученного химерного белка.
• Разработана методика количественной оценки уровня накопления слитого протективного антигена в клетках продуцентов.

Работа по отчетному периоду была направлена на наработку и очистку иммунобиологического препарата, содержащего протективный антиген B. anthracis в форме вирусоподобных частиц.

Для достижения целей проекта на данном этапе решали следующие исследовательские задачи:
1. Исследование возможности самосборки вирусоподобных частиц из созданного слитого белка «антиген протективного антигена B. anthracis — белок бактериофага.
2. Отработка условий бесколоночной очистки вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.
3. Отработка условий гель-фильтрации частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.
4. Разработка иммунобиологического препарата на основе вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis и оформление лабораторного регламента его получения.
5. Наработка экспериментальных образцов иммунобиологического препарата на основе вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.

В течение отчетного периода работы были получены следующие наиболее важные результаты:

• В результате произведенных исследований возможности самосборки вирусоподобных частиц, установлено, что при экспрессии химерного белка ТТРРА, содержащего протективный антиген anthracis, происходит самопроизвольное формирование сферических вирусоподобных частиц, пригодных для целей настоящего проекта.
• Подобраны условия и разработан протокол бесколоночной очистки вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.
• Подобраны условия гель-фильтрации вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B.anthracis, при которых выход очищенных частиц массой ~20 мДа во фракции свободного объема составляет около 35% от общего белка исходного препарата, то есть, ~3 мг. Объем фракций, содержащих целевой белок составляет 6 мл.
• Разработан лабораторный регламент получения иммунобиологического препарата на основе вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.
• Наработаны экспериментальные образцы иммунобиологического препарата на основе вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B.anthracis, представляющие собой устойчивый при хранении стерильный апирогенный коллоидный раствор, содержащий 409,2 мг общего белка (не менее 3,4 мг/мл).

Проведены работы по патентованию результатов проекта. Подана заявка на изобретение № 2015146604 от 29.10.2015 г. «ДНК-конструкция, кодирующая модифицированный вариант протективного антигена Bacillus anthracis».

В течение 4 этапа работы были получены следующие наиболее важные результаты, удовлетворяющие требованиям Технического задания:

• Доказана высокая стабильность и гомогенность ВПЧ, сформированных белком – продуктом конструкции pTTPPA.
• Разработаны и испытаны полностью оригинальные тест-системы для оценки величины бласт-трансформации смешанной популяции лейкоцитов мыши. На основе разработаной тест-системы апробирована методика оценки токсиннейтрализующих титров антител.
• Показано, что иммунизация мышей протективным антигеном в форме ВПЧ приводит к существенно более интенсивному образованию Т-лимфоцитов специфичных к протективному антигену B. anthracis, чем иммунизация растворимым протективным антигеном в очищенном виде или в форме коммерчески доступной живой вакцины. Уровень продукции токсиннейтрализующих антител при иммунизации животных экспериментальным образцом — протективным антигеном B. anthracis в форме ВПЧ в среднем в два раза выше, чем при иммунизации протективным антигеном в растворимой форме.
• Проведено материально-техническое обеспечение выполнения работ этапа за счет внебюджетных средств индустриального партнера ПНИЭР. Затраты были связаны с закупкой реактивов и лабораторных материалов для наработки экспериментальных образцов иммунобиологического препарата на основе вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.

На 5 (заключительном) этапе ПНИЭР:

• Исследованы технологически важные характеристики экспериментального образца иммунобиологического препарата протективного антигена B. anthracis в форме вирусоподобных частиц: физико-химические свойства, гомогенность, стойкость при хранении.
• Доказана высокая стабильность и гомогенность ВПЧ, сформированных белком – продуктом конструкции pTTPPA. Методом динамического светорассеяния показано, что их размер составляет около 48 нм, который практически не меняется при хранении в течение 1-4 месяцев.
• Проведена иммунизация мышей экспериментальным образцом иммунобиологического препарата.
• Выполнены исследования иммуногенности экспериментального образца иммунобиологического препарата протективного антигена B. anthracis в форме вирусоподобных частиц in vitro, в том числе, в реакции бласт-трансформации лейкоцитов с оценкой результата с помощью ПЦР в реальном времени.
• В тестах in vitro с применением методов оценки скорости бласт-трансформации смешанной культуры лейкоцитов показано, что иммунизация мышей протективным антигеном в форме ВПЧ приводит к существенно более интенсивному образованию Т-лимфоцитов специфичных к протективному антигену B. anthracis, чем иммунизация растворимым протективным антигеном в очищенном виде или в форме коммерчески доступной живой вакцины. Бласт-трансформация В-лимфоцитов в СМЛ животных, иммунизированных протективным антигеном в форме ВПЧ, также идет интенсивнее, чем в случае СМЛ животных, иммунизированных протективным антигеном в растворимой форме.
• Выполнены исследования экспериментального образца иммунобиологического препарата протективного антигена B. anthracis в форме вирусоподобных частиц in vivo по уровню продукции токсин-нейтрализующих антител. Показано, что уровень продукции токсин-нейтрализующих антител при иммунизации животных экспериментальным образцом ‒ протективным антигеном B. anthracis в форме ВПЧ в среднем в два раза выше, чем при иммунизации протективным антигеном в растворимой форме.
• Подана заявка на патент РФ № 2015146604 от 29.10.2015 г. «ДНК-конструкция, кодирующая модифицированный вариант протективного антигена Bacillus anthracis».

За все время реализации проекта (2014-2016 гг.) опубликовано 4 статьи в рецензируемых научных журналах.

ИНМИ РАН и ISE Extremophiles явились организаторами проведения Х Международного конгресса по экстремофилам («Extremophiles-2014», 10th International Congress on Extremophiles; www.extremophiles2014.ru), Санкт-Петербург, 7–11 сентября 2014 г. Председатель оргкомитета конгресса – Бонч-Осмоловская Е.А. На пленарных секциях представили свои доклады-лекции 5 сотрудников ИНМИ РАН. Общее число участников конгресса – 856 чел. из 40 стран (в том числе 33 сотрудника ИНМИ РАН; из них 13 – молодые ученые).

Проект направлен на создание научно-технологических решений, обеспечивающих разработку экологически безопасной, высокоскоростной, энергоэффективной технологии переработки органической фракции твердых бытовых отходов (ТБО) и осадков сточных вод в метан на основе анаэробной микробной ферментации для уменьшения антропогенной нагрузки полигонов ТБО на окружающую среду. Результаты настоящего проекта найдут широкое применение в таких отраслях, как коммунальное хозяйство городов (очистные сооружения, сбор и утилизация ТБО), компании, занимающиеся утилизацией различных органических отходов, и также предприятия пищевой и перерабатывающей отрасли. В перспективе будет разработана и внедрена технология высокоскоростной анаэробной ко-ферментации органического вещества твердых бытовых отходов (ТБО) и осадков сточных вод (ОСВ) с получением метана и биоудобрений. Полученные результаты позволят:
— вывести на рынок новую научно-техническую продукцию, разработать технологию мирового уровня, разработать  более совершенную микробную технологию обработки ОФ-ТБО;
— заместить импорт и обеспечить экспортный потенциал: импорто-замещение продукции зарубежных компаний, производящих реакторы и системы жидкофазной ферментации ОСВ, а также компаний, производящих системы микробиологической очистки жидкой фракции сброженной массы от азота с применением процесса анаммокс;
— получить значимые научные результаты, позволяющие переходить к созданию новых видов научно-технической продукции;
— создать технологический задел для широкомасштабного применения в России технологии ко-ферментации ОФ-ТБО и ОСВ.

• Выполнен аналитический обзор научных и информационных источников, затрагивающих научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ, указывающий на ее актуальность.
• Проведены патентные исследования, свидетельствующие о новизне предлагаемого подхода.
• Обоснован выбор исследований в области применения микроорганизмов для разработки технологических основ утилизации органических загрязнений.
• Разработаны лабораторные методики (молекулярные, физиологические и культуральные) анализа ключевых групп микроорганизмов, важных для утилизации органических загрязнений.
• Создана базовая математическая динамическая модель превращения органического вещества в биогаз на основе данных научной и технической литературы, которая позволяет с достаточно высокой точностью интерпретировать существующие или получаемые экспериментальные данные.
• Разработаны Программа и методики экспериментальных исследований для определения оптимальных значений параметров исследуемых ключевых процессов.
• Разработаны эскизные конструкторские документации на испытательные (лабораторные) стенды, которые позволяют перейти к изготовлению испытательных (лабораторных) стендов и проведению на них экспериментальных исследований.

На средства индустриального партнера, ЗАО «Компания «ЭКОС», проведены предусмотренные проектом работы:
— Проведено инженерно-техническое обследование на местах действующих полигонов ТБО и станций очистки сточных вод.
— Обоснована целесообразность совместной анаэробной обработки органической фракции ТБО и ОСВ с получением метана.
— Разработана эскизная конструкторская документация на образец комплексной экспериментальной установки, включающей анаэробный биореактор, систему механического и физико-химического сгущения осадка, и реакторов частичной нитрификации и анаммокс. Проведено материально-техническое обеспечение работ.
— Принято участие в мероприятиях, направленных на освещение и популяризацию промежуточных результатов работы.

На этапе 3 в период с 1 июля 2015 г. по 31 декабря 2015 г. выполнены следующие основные работы:

• Разработаны и изготовлены испытательные (лабораторные) стенды для проведения экспериментальных исследований на модельных субстратах и реальном сырье.
• Проведены экспериментальные исследования процессов анаэробного сбраживания ОФ-ТБО метаногенными микробными сообществами, частичной нитрификации и анаммокс на испытательных (лабораторных) стендах по разработанным Программе и методикам.  В результате проведенных исследований показано, что ко-ферментация ОСВ и ОФ-ТБО происходит стабильно даже при предельно высокой нагрузке по органическому веществу и по сравнению со сбраживанием  ОСВ позволяет увеличить скорость и  выход биогаза до трех раз. Подобрана оптимальная концентрация флоккулянта для эффективного обезвоживания сброженной массы и отделения иловой воды. В реакторах частичной нитрификации-анаммокс удаляется  до 85%  азота из минеральной среды и иловой воды анаэробного биогазового реактора. Полученные результаты позволяют перейти к обобщению и интерпретации результатов экспериментальных исследований, корректировке базовой математической модели и разработке документации на микробные сообщества и микробиологические процессы.

На средства индустриального партнера, АО «Компания «ЭКОС», проведены предусмотренные проектом работы:
Разработана экспериментальная установка, состоящая из гомогенизатора ОФ-ТБО, биогазового реактора, системы механического и физико-химического сгущения сброженного осадка и отделения иловой воды, а также реакторов частичной нитрификации и анаммокс с иммобилизацией активного ила путем ершовой загрузки.
Проведено материально-техническое обеспечение работ по разработке экспериментальной установки.

Основные результаты 4 этапа выполнения проекта:

За счет средств субсидии:

• Проведена обработка, обобщение и интерпретация результатов экспериментальных исследований
• Проведено сопоставление результатов теоретических и экспериментальных исследований.
• Выполнена проверка и корректировка базовой математической модели.
• Разработана документация на микробные сообщества и микробиологические процессы.

За счет внебюджетных средств:

• Проведены гидравлические испытания и пуско-наладочные работы на комплексной экспериментальной установке.
• Выполнена инокуляция биореакторов комплексной экспериментальной установки.
• Руководитель и исполнители проекта на четвертом этапе выполнения проекта приняли участие в 2-х мероприятиях, направленных на освещение и популяризацию промежуточных результатов работы. Высокий уровень представленных работ подтверждается двумя дипломами и золотой медалью за лучшую работу.

На 5 (заключительном) этапе проекта выполнены следующие виды работ:

• Проведена обработка, обобщение и интерпретация результатов экспериментальных исследований, которая показала, что  ко-ферментация ОСВ и ОФ-ТБО позволяет увеличить скорость образования биогаза в 2.5-2.7 раз, по сравнению со сбраживанием  в реакторе только ОСВ.
• Проведена проверка и корректировка базовой математической модели ко-ферментации ОСВ и ОФ-ТБО на основе сравнения расчетных и экспериментальных данных. В экспериментах выход биогаза от расчётного составлял от 71% (при использовании только ОСВ) и повышается с увеличением доли ОФ-ТБО в смеси с ОСВ до 83%. Близкие значения экспериментального и расчётного выхода биогаза свидетельствуют о правильной оценке состава субстрата и степени его разложения в реакторе.
• Успешно проведены гидравлические испытания, пуско-наладочные работы  и инокуляция биореакторов на комплексной полностью автоматизированной экспериментальной установке с емкостью  в биогазового реактора 200 л.
• Разработан лабораторный регламент технологического процесса  ко-ферментации ОСВ и ОФ-ТБО.
• Эффективность удаления аммонийного азота из иловой воды в системе последовательно соединенных реакторов частичной нитрификации и анаммокс при температуре 30оС  достигла в среднем 73%.
• Проведено технико-экономическое обоснование разработанной  технологии.
• Проведены маркетинговые исследования с целью изучения перспектив коммерциализации РИД и разработаны рекомендации по использованию результатов ПНИ в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и разработках.
• Разработан проект технического задания на проведение ОКР по теме: «Разработка экспериментальной установки полного цикла анаэробной переработки органической фракции твердых бытовых отходов (ТБО)».

Цель — разработка метода синтеза цефалоспориновых антибиотиков с использованием биокатализатора на основе новой рекомбинантной синтазы цефалоспоринов-кислот.

Задачи проекта: Расшифровка последовательности генома штамма E. Coli CZ-08 – продуцента синтетазы цефалоспоринов-кислот (CASA), идентификация гена CASA, создание эффективных штаммов-продуцентов CASA, создание гетерогенного технологического биокатализатора на основе рекомбинантной CASA, разработка метода синтеза цефазолина с использованием биокатализатора на основе рекомбинантной CASA. 

• Проведен подробный анализ научной и патентной литературы по проблемам ферментативного синтеза бета-лактамных антибиотиков, в том числе класса цефалоспоринов-кислот, получению рекомбинантных ферментов для синтеза цефалоспориновых антибиотиков, их аналогов с использованием методов молекулярного моделирования и белковой инженерии, создания биокатализаторов на их основе.
• Методами высокопроизводительного секвенирования расшифрован геном штамма E.coli CZ-08, ген CASA идентифицирован как гомолог гена PGA.
• Ген CASA выделен, клонирован в оригинальный вектор экспрессии, получен эффективный штамм-продуцент CASA.
• На основании предварительного анализа информационных источников, на примере пенициллин G ацилазы (PGA), выявлены некоторые проблемы в создании эффективных рекомбинантных штаммов-продуцентов нативных и мутантных форм PGA, заключающиеся в подборе условий культивирования штамма E.coli – реципиента, метода экстракции из биомассы штамма E.coli функционально-активной PGA, иммобилизации PGA на различных носителях.
• Проведены патентные исследования, направленные на выявление патентных и не патентных источников информации, посвященных различным аспектам ферментативного синтеза цефалоспориновых антибиотиков, использованию современных достижений биотехнологии, энзимологии, генетической и белковой инженерии для создания более эффективных промышленных биокатализаторов для получения антибиотиков класса цефалоспоринов-кислот.
• Разработана аналитическая методика определения ферментативной активности CASA, позволяющая характеризовать по синтетазной активности биомассу клеток рекомбинантного штамма, получаемые из нее ферментные препараты разной степени очистки и гетерогенный биокатализатор на основе CASA.
• Разработана аналитическая методика контроля процесса биокаталитического синтеза цефазолина с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, позволяющая проводить операционные испытания технологического биокатализатора на основе CASA с целью определения таких технологических характеристик как максимальная степень превращения бета-лактам-содержащего субстрата в цефазолин и период полуинактивации БК, а также осуществлять динамический контроль процесса синтеза по обоим субстратам, целевому и побочному продуктам ферментативной реакции для исследовательских целей.
• Привлечены внебюджетные средства в объеме 450 000 рублей, израсходованные на ремонт и закупку технологического оборудования, проведение патентных исследований, биоинформационный анализ последовательностей генома штамма E.coli CZ-08.

• Была расшифрована геномная последовательность штамма E.coli – продуцента CASA, выявлены множественные полиморфизмы и различия в наборах кодируемых генов по сравнению с геномом родительского штамма. Методами биоинформатики ген CASA идентифицирован как прямой гомолог гена пенициллин G ацилазы. Вывод подтвержден результатами клонирования гена, его экспрессии, определения ферментативной активности в реакции синтеза цефазолина;
• Ген CASA был выделен, клонирован в оригинальный вектор экспрессии. При оптимизации вариантов конструкций вектора и условий культивирования получен штамм-продуцент E.coli с высоким уровнем продукции CASA;
• Был разработан высокоэффективный метод получения гетерогенного биокатализатора на основе рекомбинантной CASA для процессов ферментативного синтеза цефазолина;
• Была разработана аналитическая методика контроля процесса биокаталитического синтеза цефазолина, позволяющая проводить операционные испытания технологического биокатализатора на основе CASA с целью определения таких технологических характеристик как максимальная степень превращения бета-лактам-содержащего субстрата в цефазолин и период полуинактивации биокатализатора, а также осуществлять динамический контроль процесса синтеза для исследовательских целей;
• Был разработан проект ТУ на технологический биокатализатор на основе рекомбинантной CASA. (35-40 МЕ/мл культуры), что в 2-3 раза превосходит известные аналоги. Ферментативная активность полученных образцов биокатализаторов составила 185-280 МЕ/г влажного биокатализатора, содержание сухих веществ — 31-33%, период полуинактивации – 140-210 циклов.

• Разработан проект ТУ на технологический БК на основе рекомбинантной CASA.
• Проведена работа по оптимизации условий биокаталитического синтеза ЦЕЗ, катализируемого ИФCASA, по критерию достижения максимального выхода продукта. Исходя из
  установленной ТЗ эффективности биокаталитического синтеза ЦЕЗ более 80 % выбран диапазон
  операционных значений параметров процесса.
• Разработана лабораторная технология биокаталитической трансформации ММТД-7-АЦК в ЦЕЗ
  методом кинетически контролируемого синтеза с использованием ацилирующего агента.
• Разработан «Лабораторный технологический регламент процесса биокаталитического синтеза
  цефазолина» (проект), оформленный в виде отдельного документа с учетом требований ОСТ 64-
  02-003-2002.
• Разработан проект ТЗ на проведение прикладной ОТР.
• Доклады по результатам исследований, проведенных в рамках проекта, представлены на
  конференциях.

Целью проекта является комплексный анализ генетического разнообразия и распространенности на территории Крымского полуострова вирусных и бактериальных фитопатогенов для разработки прототипов диагностических наборов, основанных на современных инструментальных методах.

За счет средств субсидии:

• Проведен аналитический обзор информационных источников по теме проекта. Список использованных источников содержит 46 наименований, 30 из них — за период 2009 – 2013 гг.
• Обоснованы и выбраны направления исследований.
• Проведены патентные исследования.
• Проведено обследование виноградников на наличие растений с внешними признаками поражения вирусными и бактериальными инфекциями.

За счет внебюджетных источников:

Проведены маркетинговые исследования рынка тест-наборов для диагностики фитопатогенных вирусов и бактерий и средств химической защиты растений для снижения вредоносности вирусов и бактерий на винограде и других древесных культурах.

• Разработана программа и методики испытаний макетов тест-систем. По этой программе были проведены испытания макетов тест-систем с использованием нуклеиновых кислот фитопатогенов из референтной коллекции, нуклеиновых кислот нецелевых микроорганизмов, встречающихся на растениях; биоматериала растений винограда Крыма с внешними признаками заболеваний и контрольных (не зараженных) растений. Тест системы показали высокую специфичность с чувствительность к анализируемым патогенам.
• Разработаны проекты ТУ и лабораторные технологические регламенты изготовления тест-систем для идентификации возбудителей вирусных и бактериальных заболеваний винограда, распространенных на территории Крыма и Инструкций по применению тест-систем по результатам испытаний.
• Подготовлен проект технического задания на проведение ОКР по теме: «Разработка комплексных тест-систем для идентификации и анализа прогрессирующих, в том числе карантинных, вирусных и бактериальных фитопатогенов в Крыму».
• Проведена оценка полноты решения задачи и достижения поставленных целей ПНИ.
• Составлены технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации макетов тест-систем с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера-организации реального сектора экономики;
• Проведены дополнительные маркетинговые исследования рынка тест-наборов для диагностики фитопатогенных вирусов и бактерий и средств химической защиты растений для снижения вредоносности вирусов и бактерий на винограде и других.