Ключевые слова
геном базидиомицетов, структура и функции оксидоредуктаз, биологически активные пептиды, рекомбинантные ферменты грибов, биохимия и физиология базидиомицетов, тестирование на культурах клеток и лабораторных животных, транскриптом, протеом и секретом базидиомицетов, технологии биоремедиации на основе базидиомицетов, пищевые биотехнологии, пищевая продукция

Направления исследований

• Исследование организации мультигенных семейств лакказ и пероксидаз у базидиальных грибов – возбудителей белой гнили древесины
• Изучение закономерностей экспрессии и продукции ферментов древоразрушающими базидиальными грибами
• Изучение физиолого-биохимических особенностей базидиальных грибов – возбудителей белой гнили древесины
• Исследования структуры, физико-химических, биохимических и каталитических свойств ферментов лигнолитического и целлулолитического действия
• Изучение генома базидиомицета Trametes hirsuta
• Протеом и секретом базидиомицетов
• Исследование взаимосвязи структуры биологически активных пептидов и их биологических свойств
• Исследование функциональных пищевых ингредиентов и функциональных продуктов питания на их основе
• Разработка технологий  биоконверсии отходов животного происхождения
• Исследование взаимодействия гуминовых веществ и базидиальных грибов

Основные методы исследований
В рамках фундаментальных и прикладных исследований лаборатория реализует полный цикл разработки технологий биоконверсии отходов животного происхождения (пищевой промышленности) – от разработки мультиферментной композиции на основе in silico моделирования до создания промышленной технологии и всесторонней характеристики целевых продуктов. Данный цикл включает как традиционные, так и специальные (в том числе разработанные в лаборатории) методы и подходы.

• in silico моделирование рационального дизайна мультиферментной композиции;
• оптимизация технологических параметров с использованием многофакторного эксперимента
• характеристика физико-химических и биофункциональных свойств целевых продуктов;
• оценка антиоксидантной емкости,  гипотензивной, антимикробной, бифидогенной, противоопухолевой, нейропротективной и др. активностей  индивидуальных веществ и многокомпонентных смесей in vitro;
• оценка гипохолестеримических, гепатопротекторных, гипотензивных, антиоксидантных свойств и влияния на микробиоценоз кишечника индивидуальных веществ и многокомпонентных смесей in vivo.

Методы фундаментальных исследований:
Исследования лаборатории в области изучения базидиомицетов – возбудителей белой гнили древесины включают полный цикл от генетической идентификации штаммов и их физиолого-биохимической характеристики до профиля секретируемых ферментов, оценки уровня экспрессии генов как в норме, так и при  различных условиях культивирования и верификации на уровне белкового продукта (секретом и протеом), выделения и характеристики индивидуальных ферментов на структурном и молекулярном уровнях:

• микробиологические культуральные работы
• молекулярно-генетические методы
• ПЦР в реальном времени
• ДНК-фингерпринт
• широкомасштабное параллельное секверирование (секвенирование полных геномов, транскриптомов, секвенирование отдельных участков генома после целевого обогащения)
• определение ферментативных активностей и иммуноферментный анализ (ELISA) для количественной оценки уровня продукции белка
• гибридизация по Нозерну для определения количества мРНК
• проведение протеомных исследований (2D-электрофорез, MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрия), а так же разработка методов получения внутриклеточных и внеклеточных белковых экстрактов для них.
• транскрипционный анализ микроорганизмов (получение мРНК, супрессионная вычитающая гибридизация и зеркально-ориентированная селекции образцов кДНК, RACE ПЦР, qPCR, ddPCR)
• очистка ферментных препаратов хроматографическими методами и оценка чистоты белковых препаратов электрофоретическими методами
• исследование ферментативной кинетики окисления субстратов различной природы лакказами методом амперометрии и спектрофотометрии
• изучение физико-химических свойств ферментов методами электрофореза в ПААГ, изоэлектрофокусирования, потенциометрического титрования, UV/Vis-спектроскопии, ЭПР-, КД-спектроскопии.
• определение пространственной структуры белков методом рентгеноструктурного анализа.

Краткая история лаборатории
В 2002 году был создан ВНК «Ферментативные основы биодеградации» под руководством к.б.н. Королевой О.В., из которого в 2005 году образована группа «Ферментативные основы биодеградации». Лаборатория была создана в 2008 году по направлению физиология и биохимия древоразрушающих базидиомицетов и продуцируемых ими ферментов, руководитель д.б.н. Королева О.В.

ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

Лаборатория занимается исследованиями в области экологии, морфологии, физиологии, биохимии, энзимологии и генетики базидиальных грибов. Проводятся исследования по секвенированию и аннотированию генома базидиального гриба Тrametes hirsuta. С использованием технологии 454 пиросеквенирования оценен состав мультигенных семейств кодирующих лакказы у 14 видов базидиальных грибов из Коллекции LE-BIN, относящихся к различным таксономическим группам и обитающих в различных экологических нишах.  Лакказные мультигенные семейства у всех исследованных грибов состоит из  5-7 генов в среднем. Проведенный филогенетический анализ показал общую тенденцию представителей лакказных мультигенных семейств одного вида гриба не объединяться в одну кладу на филогенетическом дереве — кластеризация генов наблюдается на уровне семейств. Ведутся исследования транскриптомов, протеомов и секретомов  различных грибов белой гнили, в том числе ряда мультигенных семейств лигнолитического и целлюлолитического ферментных комплексов изучаемых грибных штаммов. Исследование ферментов лигнолитического комплекса проводится на молекулярном и структурном уровнях – получены структуры с разрешением ниже 1 ангстрема.

В лаборатории проводится исследование механизма ферментативной реакции восстановления молекулярного кислорода окидоредуктазой – лакказой  кинетическими, физико-химическими методами, а также методом рентгеноструктурного анализа: изучение динамики изменения структуры фермента под действием ионизирующего излучения в зависимости от поглощенной образцом дозы.

Основные исследования, проводимые в лаборатории, направлены на изучение физиолого-биохимических и генетических особенностей базидиальных грибов, биосинтеза ими лигнолитических ферментов, изучение молекулярно-генетической организации и структуры, функции и механизма действия данных ферментов и их физиологической роли. В рамках исследования физиологической роли ферментов базидиомицетов проводится изучение роли лакказы в процессе синтеза гуминовых веществ и физиологическая роль полученных гуминоподобных веществ в том числе на клеточном и молекулярном уровнях. В рамках данного направления проводится изучение молекулярных основ процесса детоксификации ксенобиотиков базидиальными грибами.

Вторым направление исследований, проводимых в лаборатории является изучение биологически активных соединений преимущественно пептидов, полученных биокаталитической конверсией сырья животного происхождения по разработанной технологии, которая реализуется производителями на пилотном и/или промышленном уровне.  Совместно с производителями также разрабатываются технологии получения новых функциональных ингредиентов и функциональных продуктов питания на их основе. Изучение функциональности  разработанных ингредиентов и продуктов питания включает работы на молекулярном, клеточном и организменном уровнях.

Основные достижения:

• Идентифицированы и филогенетически отпозиционированы более 20 штаммов базидиальных грибов – продуцентов высоко редокспотенциальных лакказ из коллекции базидиомицетов Ботанического института им. В.Л. Комарова. Исследована динамика синтеза окислительных ферментов в процессе твердофазного и жидкофазного культивирования базидиомицетов Тrametes hirsuta, Тrametes gibbosa, Androdiella faginea, Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius, Steccherinum murashkinskyi, Bissomerulius avellaneus, Flammula sterlimulatoides, Irpicodon pendulus и Coriolopsis fulvocenerea (=Coriolopsis caperata). Проведен подбор оптимальных условий культивирования перечисленных грибов для максимальной продукции оксидаз путем варьирования состава сред, в том числе источников углерода и азота в сочетании с внесением различных концентраций индуктора биосинтеза лакказ – ионов меди.
• Оптимизированы условия выделения и очистки до гомогенного состояния лакказ из культуральных жидкостей грибов Cerrena maxima, Trametes hirsuta, Coriolopsis caperata, Trametes ochracea, Androdiella faginea, Steccherinum murashkinskyi, Trametes gibbosa, Lenzites betulina. Впервые изучены биохимические (молекулярная масса, изоэлектрическая точка, рН- и термооптимумы в различных буферных системах) и физико-химические свойства (оптические спектры, КД и ЭПР спектры) и каталитические характеристики очищенных ферментных препаратов лакказ грибов базидиомицетов из различных экологических ниш.
• В настоящее время активно ведутся работы по изучению структурно-генетической организации низко-, средне- и высоко-редокспотенциальных лакказ. Разработаны универсальные праймеры для идентификации лакказных генов. Определены полные нуклеотидные и аминокислотные последовательности и редокс-потенциал медного центра Т1лакказ из базидиомицетов T.hirsuta, C.maxima, C.zonatus (=T.ochracea), C.fulvocinerea (=C.caperata), A.faginea, P.ostreatus, S. murashkinskyi, L. betulina и T. gibbosa. Определена экзон-интронная структура генов лакказ у данных грибов.
• Впервые проведена гетерологическая экспрессия лакказы базидиомицета Тrametus hirsuta в грибах Penicillium canescens. Разработан протокол получения антител на нативный и дегликозилированный фермент для использования в иммуноблоттинге и иммуноферментном анализе при скрининге трансформантов и природных штаммов, продуцентов лакказы. Изучены биохимические и каталитические свойства рекомбинантной лакказы. Проведен их сравнительный анализ со свойствами нативного фермента. Собран набор кристаллографических данных с кристаллов рекомбинантной лакказы с разрешением 2.3 Å и решена ее структура.
• Решены и уточнены структуры лакказ с высоким разрешением (от 0.9 до 2.0 Å) грибов-продуцентов Cerrenamaxima, Trameteshirsuta, Coriolopsiscaperata, Trametesochracea, Steccherinummurashkinskyi и Androdiellafaginea. Впервые получена структура нативногоинтермедиата, содержащего в центре трехядерного кластера дополнительный кислородный лиганд (лакказа T. hirsuta).
• Получен ряд структур лакказы из гриба S. murashkinskyi c разрешением от 0.8 Å до 1.5 Å, отличающихся положением кислородных лигандов в центре Т2-Т3, и структуры комплексов фермента с кислородными лигандами, соответствующими промежуточным соединениям, образующимся в процессе ферментативного катализа. На основе полученных рентгеноструктурных данных предложен возможный механизм катализа грибных лакказ.
• Проведена модификация лакказы комплексами рутения и показано, что эффективность полученной системы фермент-редокс-медиатор зависит от условий проведения модификации и размеров встраиваемого рутенокомплекса. Показано, что в модифицированной лакказе встроенные Ru-комплексы влияют на процесс ферментативного катализа. Определены основные физико-химические и кинетические характеристики модифицированных ферментов, которые указывают на возможность создания нового биокатализатора, содержащего лакказу и комплексы рутения.
• Проведена оценка биологической активности продуктов, образующихся при биосолюбилизации угля с использованием базидиомицета Coriolushirsutus (=T. hirsuta), с использованием биотестирования по методу проростков и лабораторно-вегетационных экспериментов. В качестве тест-растений использовали пшеницу мягкую Triticumaestivum L. Проведена оценка антиоксидантной емкости изучаемых продуктов. Установлено, что по отношению к проросткам наибольшей стимулирующей активностью обладает остаточная культуральная жидкость, образующаяся при выращивании C. hirsutus (=T. hirsuta) 075 в присутствии угля на полной среде. Показано, что остаточные культуральные жидкости, образующиеся при выращивании C. hirsutus (=T. hirsuta) 075 на бедной среде (без глюкозы), обладают выраженным детоксифицирующим потенциалом по отношению к атразину. При этом наибольший потенциал наблюдали для культуральных сред, обладающих максимальной лакказной активностью. Проведена адаптация метода определения антиоксидантной емкости гуминовых веществ. Высказано предположение о совместной роли карбоксильных и фенольных функциональных групп в определении антиоксидантных свойств гуминовых и гуминоподобных веществ. Результаты лабораторных опытов верифицированы в условиях полевых экспериментов. Разработанные алгоритмы легли в основу технологии биоконверсии отходов ЦБК.
• Разработана панель тестов для определения антиоксидантных свойств различных многокомпонентных систем. Охарактеризованы антиоксидантные свойства белковых гидролизатов животного происхождения содержащих в своем составе пептиды: L-Ala-L-Phe, L-Ser-L-Phe, Gly- L-Phe , L-Ala-L-Arg, L-карнозина и L-анзерина. Показано, что антиоксидантные свойства данных белковых гидролизатов в значительной мере обусловлены наличием в их составе свободного тирозина и триптофана.
• Проведены квантово-химические расчеты молекулярных и электронных дескрипторов антиоксидантных свойств дипептидов. Показано, что взаимодействие метионинсодержащих дипептидов с пероксильным радикалом реализуется по механизму одноэлектронногодонирования, а молекулярными и электронными дескрипторами антиоксидантных свойств метиониновых дипептидов являются: С-терминальное положение метионинового остатка, потенциал ионизации, электроотрицательность и электрофильность. Идентифицированы ключевые пептиды, обуславливающие АПФ-ингибирующие свойства гидролизатов коллагеновых и мышечных белков Gallusgallus.
• Разработана аналитическая платформа для исследования био-функциональных свойств функциональных пищевых ингредиентов и функциональных продуктов на их основе, включающая определение биологической активности in tubes, на линиях культивируемых клеток и на  различных моделях лабораторных животных in vivo.

Совместно с другими лабораториями Центра разработаны методы и подходы для изучения аминокислотно-пептидных композиций: пептидный состав, безопасность, органолептические свойства, функциональные характеристики, в том числе бифидогенная, антимикробная, антиоксидантная активности в рамках выполнения международного проекта 7 Рамочной программы Европейского союза PROSPARE № 212696 («PROgress in Saving Proteins And Recovering Energy»).

Создана аналитическая платформа in vitro и in vivo тестирования белково-пептидных гидролизатов и биологически активных пептидов, которая была успешно использована для исследования различных пищевых продуктов, функциональных ингредиентов и функциональных продуктов питания, прежде всего для оценки их функциональности.

В лаборатории ведутся работы по структурно-функциональному анализу биологически активных пептидов растительного и животного происхождения. Для тирозин содержащих антиоксидантных пептидов были установлены структурные дескрипторы. На основании установленных дескрипторов среди более чем 100 пептидов, идентифицированных в пептидных гидролизатах животного происхождения, было отобрано 16 новых антиоксидантных пептидов. Верификация  биологической активности биопептидов проводится на тестовых моделях in vitro и in vivo.

Разработаны способы получения гидролизованных белково-пептидных композиций и функциональных продуктов на их основе. Разработаны технологии биоремедиации загрязненных пестицидами почв и переработки отходов целлюлозно-бумажных комбинатов. На большую часть разработок получены отечественные патенты (более 10).

Лаборатория принимает участие в многочисленных исследовательских проектах совместно с другими отечественными лабораториями и международными партнерами. Партнерами Лаборатории являются:

• ГНУ ВНИ Институт молочной промышленности
• ФГБУН Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН
• ФГБУН Ботанический Институт им. В.Л. Комарова РАН
• МГУ им. М.В. Ломоносова
• Институт биохимической физики РАН, (центр масс-спектрометрии)
• Институт сельскохозяйственной и пищевой технологии Шаньдунской академии сельскохозяйственных наук
• European Molecular Biology Laboratory, University of Parma, Department of Chemistry и пр.

Исследования, проводимые сотрудниками лаборатории, поддерживались и поддерживаются как грантами РФФИ и РНФ, так и международными грантами, включая INTAS, INCO-Copernicus, CRDF, NATO – travel.

Сотрудники лаборатории ежегодно участвуют в различных отечественных и международных мероприятиях в том числе в качестве докладчиков.

В лаборатории постоянно ведется работа с молодежью и проводится работа по подготовке молодых специалистов. За время существования Лаборатории по тематике исследований были защищены 2 докторские и более 10 кандидатских диссертаций.

СОСТАВ ЛАБОРАТОРИИ

УНИКАЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

1. Koroleva OV,Stepanova EV.Gavrilova VP.Yakovleva NS.Landesman, EO.Yavmetdinov IS.Yaropolov AI. Laccase and Mn-peroxidase production by Coriolushirsutus strain 075 in a jar fermentor. — Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002, v. 93, Is. 5, p. 449-455 (DOI: 10.1263/jbb.93.449)
2. PolyakovK.M., FedorovaT.V., StepanovaE.V., CherkashinE.A., KurzeevS.A., StrokopytovB.V., LamzinV.S. and Koroleva O.V. Structure of native laccase from Trameteshirsuta at 1.8 Å resolution. — Acta Crystallographica Section D, 2009, v. 65, p. 611-617 (DOI: 10.1107/S0907444909011950)
3. Kurzeev S.A.,Vilesov A.S., Fedorova T.V., Stepanova E.V., Koroleva O.V., Bukh C., Bjerrum M.J., Kurnikov I.V., Ryabov A.D. Kinetic and Theoretical Comprehension of Diverse Rate Laws and Reactivity Gaps in Coriolushirsutus Laccase-Catalyzed Oxidation of Acido and Cyclometalated Ru-II Complexes. — Biochemistry, 2009, v. 48, Is. 21, p. 4519-4527 (DOI: 10.1021/bi8020058)
4. KulikovaN.A., PerminovaI.V., BadunG.A., ChernyshevaM.G., Koroleva O.V., Tsvetkova E.A. Estimation of Uptake of Humic Substances from Different Sources by Escherichia coli Cells under Optimum and Salt Stress Conditions by Use of Tritium-Labeled Humic Materials. — Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76, № 18, с. 6223-6230 (DOI: 10.1128/AEM.00905-10)
5. Nikolaev I.V., Lambertini F., Khotchenkov V.P., Sforza S., Koroleva O.V. Antioxidant Constituents of Functional Animal Protein. — Journal of Biotechnology, 2010, v. 150, p. 336-337 (DOI: 10.1016/j.jbiotec.2010.09.352)
6. Farver O., Wherland S., Koroleva O., Loginov D. and Pecht I. Intramolecular electron transfer in laccases. — FEBS Journal, 2011, v. 278, issue 18, p. 3463–3471 (DOI: 10.1111/j.1742-4658.2011.08268.x)
7. Lazzi C., Meli F., Lambertini F., Bottesini C., Nikolaev I., Gatti M., Sforza S., Koroleva O., Popov V., Neviani E., Dossena A. Growth promotion of Bifidobacterium and Lactobacillus species by proteinaceous hydrolysates derived from poultry processing leftovers. — International Journal of Food Science & Technology, 2013, v. 48, p. 341-349 (DOI: 10.1111/j.1365-2621.2012.03192.x)
8. Koroleva O. V., Torkova A., Nikolaev I., Khrameeva E., Fedorova T., TsentalovichM., and. Amarowicz R. Evaluation of the Antiradical Properties of Phenolic Acids. — International Journal of Molecular Sciences, 2014, 15(9), 16351-16380 (DOI: 10.3390/ijms150916351)
9. Zanello P.P., Sforza S., Dossena A., Lambertini F., Bottesini C., Nikolaev I.V., Koroleva O., Ciociola T., Magliani W., Conti S., Polonelli L. Antimicrobial activity of poultry bone and meat trimmings hydrolyzates in low-sodium turkey food. -Food & Function, 2014, v. 5, № 2, pp. 220-228 (DOI: 10.1039/C3FO60454C)
10. Vasina D.V, Mustafaev O.N., Moiseenko K.V., Sadovskaya N.S., Olga A. Glazunova O.A., Tyurin A.A., Fedorova T.V., Pavlov A.R., Tyazhelova T.V., Goldenkova-PavlovaI V., Koroleva O.V. The Trameteshirsuta 072 laccase multigene family: genes identification and transcriptional analysis under copper ions induction. — Biochimie, 2015, v.116C, p. 154-164 (DOI: 10.1016/j.biochi.2015.07.015)

1. Тестирование новых функциональных пищевых ингредиентов по параметрам биофункциональных свойств invitro, на линиях культивируемых клеток и invivo на лабораторных животных используя различные модели.
2. Полный цикл исследования биологически активных соединений: структура, биологическая активность invitroи invivo согласно отечественным и международным стандартам.
3. Разработка мультиферментной композиции на основе рационального дизайна для биоконверсии побочных продуктов пищевой промышленности, оптимизация технологических решений.
4. Определение антиоксидантных свойств индивидуальных веществ и многокомпонентных смесей методами invitro
5. Определение гипотензивных свойств  индивидуальных веществ  и многокомпонентных смесей методами  invitro
6. Характеристика функциональных свойств растительных биополимеров (в том числе пектины) и содержащих их продуктов
7. Тестирование распадаемости и растворимости лекарственных форм (таблетки, капсулы и пр.)