Ключевые слова
ферменты-карбогидразы, мицелиальные грибы, биохимические и физико-химические свойства ферментов, методы генной инженерии, экспрессия гетерологичных и гомологичных генов, промышленные ферментные препараты, продукты микробиологического синтеза

Направления исследований

• Основным направлением деятельности лаборатории является создание технологических основ эффективной конверсии возобновляемых углевод-содержащих субстратов — малоценного растительного сырья, отходов промышленности и сельского хозяйства в технические сахара и, далее, в продукты с высокой добавленной стоимостью – аминокислоты, органические растворители, карбоновые кислоты и бифункциональные  и мультифункциональные молекулы для дальнейшего использования в производственных процессах химической, кормовой, пищевой, целлюлозо-бумажной, текстильной промышленности
• Исследование биохимических и физико-химических свойств ферментов в составе секретируемого комплекса грибов Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Thelavia terrestris, Penicillium canescens, Penicillium  verruculosum и др. с целью поиска ферментов с новыми, уникальными свойствами
• Оптимизация качественного и количественного состава ферментных препаратов (рациональный дизайн) для эффективного получения простых сахаров в  результате процессов биодеградации полисахаридных субстратов растительного происхождения
• Функциональная протеомика: исследование свойств всех внеклеточных ферментов, секретируемых каким-либо штаммом-продуцентом (выделение индивидуальных ферментов, исследование их специфичности, получение структурных данных с помощью MALDI TOF или MS/MS, рН- и температурные профили, стабильность, ингибирование, и т.д.
• Определение области применения индивидуальных ферментов или ферментных препаратов (например, в текстильной, пищевой, кормовой, целлюлозно-бумажной промышленности, для получения моющих средств, для получения био-этанола и конверсии целлюлозо-содержащих материалов, получения нано-целлюлозы и т.д.)
• Разработка технологических схем переработки растительной биомассы в продукты с высокой добавленной стоимостью — органические растворители, органические кислоты, биологически активные добавки и тд., включая стадии предобработки сырья, ферментативного гидролиза, выделения конечного продукта и т.д.
• Создание миниатюризированных методов прикладного тестирования ферментов, имитирующих реальные технологические процессы  (процессы bio-finish в текстильной промышленности, отбеливание целлюлозы, in vitro кормовые испытания, удаление загрязнений, и т.д.)
• Масштабирование процессов получения ферменных препаратов в малом пилотном объеме (до 100 л культуральной среды)

Основные методы исследований

В рамках деятельности лаборатории решается ряд фундаментальных и прикладных задач. К фундаментальным задачам относятся поиск, создание с использованием молекулярно-генетических методов, выделение, анализ и описание биохимических свойств новых ферментов гидролитического действия с уникальными свойствами, а также описание и выяснение механизма действия ферментов негидролитической природы, усиливающих гидролиз растительного сырья. Поиск, разработка и создание методами метаболической инженерии эффективных микроорганизмов-продуцентов различных низкомолекулярных метаболитов, продуцентов высокоэффективных ферментов и других веществ белковой природы.

Прикладные задачи лаборатории состоят в разработке ряда рентабельных технологий, включающих стадию ферментативной переработки возобновляемого растительного сырья. Имеющийся научно-технический задел в области получения мультиферментных осахаривающих комплексов позволяет расширять спектр разрабатываемых технологий в зависимости от потребностей. К таким технологиям могут относиться как эффективное получение технических сахаров, так и получение на их основе ряда полезных продуктов- карбоновых кислот (напр. молочная, янтарная, фумаровая и т.д.) для синтеза специальных полимерных и композитных материалов, функциональных кормовых добавок, биоспиртов и т.д.

В рамках фундаментальных и прикладных исследований лаборатория реализует полный цикл разработки промышленных штаммов ферментных препаратов – от получения целевых ферментов до создания промышленной технологии. Данный цикл включает традиционные микробиологические методы, методы генной инженерии, оптимизацию и масштабирования процессов культивирования микроорганизмов, стабилизацию готовых форм, а также разработку аналитических методов контроля и методов препаративного выделения белков

К уникальным методам исследования на базе собственного оборудования следует отнести масштабирование ферментационных процессов от малого (20-200 мл) объема до среднего (10-50 л) объема культивирования с возможностью контроля ферментационного процесса в кинетическом режиме, что позволяет оптимизировать рост и продуктивность микроорганизмов. Также, в лаборатории применяются высокочувствительные хроматографические методы разделения и идентификации сахаров и полисахаридов, с использованием пульсирующего амперометрического детектора.

Краткая история лаборатории

Лаборатория биотехнологии ферментов была организована в Институте биохимии им. А.Н. Баха в 2006 году. Руководитель лаборатории – д.х.н., проф. Аркадий Пантелеймонович Синицын.

Начиная с 2006 года на базе лаборатории было подготовлено 9 кандидатов наук, 10 дипломников по специальностям «химия» и «биотехнология». Сотрудниками лаборатории подготовлено более 100 научных публикаций, получено 5 патентов. На базе лаборатории выполнено около 25-ти проектов в области биотехнологии и промышленной энзимологии, из них 6-ть с международным участием. Были разработаны научно-технологические основы биопроцессов для многих областей промышленности. На базе созданных в лаборатории штаммов-продуцентов и технологий было построено первое в пост-советской России современное промышленное предприятие по производству ферментных препаратов.

Проведение фундаментальных научных и прикладных исследований лаборатории Биотехнологии ферментов тесно связано с Химическим факультетом МГУ имени М.В. Ломоносова, Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина, а также Институтом пищевой биотехнологии.

ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

В настоящее время лаборатория выполняет проекты:

• «Адаптация и применение методов геномного редактирования для изучения транскрипционно-активаторного механизма гриба Penicillium verruculosum» (РФФИ, 2018-2021)
  КАРТОЧКА ПРОЕКТА

• «Технологическая платформа БРИКС для создания интегрированных устойчивых биопроцессов получения биотоплива и сопутствующих продуктов из сельско-хозяйственных отходов» (РФФИ, 2018-2021)
  КАРТОЧКА ПРОЕКТА

В период существования лаборатории Биотехнологии ферментов ИНБИ РАН (с 2006 г по настоящее время) был получен ряд научных и научно-практических результатов:

Научные результаты:

• Исследование свойств и механизмов действия ферментов-карбогидраз, оптимизация состава мультиферментных комплексов для эффективного гидролиза различных видов растительной биомассы;
• Создание системы гомологичной и гетерологичной экспрессии генов в клетках низших эукариотов (Aspergillus, Penicillium, Aspergillus и тд);
• Создание новых штаммов-продуцентов карбогидраз (около 40 новых штаммов);
• Исследование молекулярных механизмов ферментативной трансформации целлюлозосодержащих субстратов под действием гидролаз и оксидаз;
• Рациональный дизайн белковых молекул для улучшения операционных и технологических свойств ферментов;
• Разработка высокочувствительных методов анализа продуктов ферментативного гидролиза полисахаридов.

Научно-практические результаты:

• Разработаны технологические процессы и средства технологического оснащения для экологически безопасной и энергоэффективной биоконверсии непищевого целлюлозосодержащего сырья в простые сахара. Создано опытно-промышленное производство простых сахаров из непищевого целлюлозосодержащего сырья мощностью 300 тонн/год.
• Разрабатываемые технологические процессы предназначены для эффективной предобработки целлюлозосодержащих материалов с дальнейшим ферментативным превращением в простые сахара (гексозы, пентозы) и последующим внедрением на предприятиях, заинтересованных в получении высокотехнологичных продуктов глубокой переработки возобновляемого растительного сырья, в том числе на предприятиях бывшей гидролизной промышленности, химической промышленности и полимерного синтеза, кормовой и пищевой промышленности.

СОСТАВ ЛАБОРАТОРИИ

ИННОВАЦИОННЫЕ РАЗРАБОТКИ

УНИКАЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

1. Dotsenko A.S., Dotsenko G.S., Senko O.V., Stepanov N.A., Lyagin I.V., Efremenko E.N.,  Gusakov A.V., Zorov I.N., Rubtsova E.A. Complex effect of lignocellulosic biomass pretreatment with 1-butyl-3-methylimidazolium chloride ionic liquid on various aspects of ethanol and fumaric acid production by immobilized cells within SSF, Bioresource Technology, 2018, v.250, p.429-438
2. Доценко A.С., Гусаков А.В., Рожкова А.М., Волков П.В., Синицын А.П., Ферментативный гидролиз целлюлозы смесями мутантных форм целлюлаз Penicillium verruculosum, Вестн.Моск.Ун-та. Серия 2. Химия, 2018, т.59, №2, с.138-143
3. Рожкова А.М., Мерзлов Д.А., Баширова А.В., Зоров И.Н., Короткова О.Г., Шашков И.А., Синицын А.П. Новый ферментный препарат для снижения вязкости цельнозерновых экстрактов ржи, Вестн.Моск.Ун-та. Серия 2. Химия, 2018, т.59, №2, с.132-137
4. Короткова О.Г., Рубцова Е.А., Шашков И.А., Волчок А.А., Кондратьева Е.Г., Синицына О.А., Рожкова А.М., Сатрудинов А.Д., Денисенко Ю.А., Синицын А.П. Сравнительный анализ состава и свойств кормовых ферментных препаратов, Катализ в промышленности, 2018, т.18, №4, с.72-78
5. Dotsenko A., Gusakov A., Rozhkova A., Sinitsyna O., Sinitsyn A. Enzymatic hydrolysis of cellulosic materials using synthetic mixes of purified cellulases bioengineered at N-glycosylation sites, 3 Biotech, 2018, 8:396, http://doi.org/10.1007/s13205-018-1419-4
6. Семёнова М.В., Волков П.В., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Синицын А.П. Клонирование, выделение и изучение свойств новой гомологичной экзо-арабиназы гриба Penicillium canescens, Прикладная биохимия и микробиология, 2018, т.54, №4, с.375-384
7. Volkov P.V., Gusakov A.V., Rubtsova E.A., Rozhkova A.M., Matys V.Yu.,  Nemashkalov V.A., Sinitsyn A.P. Properties of recombinant GH49 family dextranase heterologously expressed in two recipient strains of Penicillium species, 2019, Biochimie, v.157,  р.123-130, https://doi.org/10.1016/j.biochi.2018.11.010
8. Denisenko Y., Rozhkova A., Zorov I., Bashirova A., Matys V., Nemashkalov V., Sinitsyn A., Gusakov A. Protein engineering of GH10 family xylanases for gaining a resistance to cereal proteinaceous inhibitors, 2019, Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, https://doi.org/10.1016/j.bcab.2019.01.042 , v.17, p.690-695
9. Semenova M.V., Gusakov A.V., Volkov P.V., Matys V.Yu., Nemashkalov V.A., Telitsin V.D., Rozhkova A.M., Sinitsyn A.P. Enhancement of the enzymatic cellulose saccharification by Penicillium verruculosum multienzyme cocktails containing homologously expressed lytic polysaccharide monooxygenase, Molecular Biology Reports, https://doi.org/10.1007%2Fs11033-019-04693-y
10. Bashirova А., Pramanik S., Volkov P., Rozhkova A., Nemashkalov V., Zorov I., Gusakov A., Sinitsyn A., Schwaneberg U., Davari M. Disulfide bond engineering of an endoglucanase from Penicillium verruculosum to improve its thermostability,  International Journal of Molecular Science, 2019, v.20, 1602, doi.org/10.3390/ijms20071602
11. Semenova M., Gusakov A., Telitsin V., Rozhkova A., Sinitsyn A. Purification and characterization of two forms of the homologously expressed lytic polysaccharide monooxygenase (PvLPMO9A) from Penicillium verruculosum, BBA-Protein and Proteomics, 2020, doi.org/10.1016/j.bbapap.2019.140297 1868(1),140297
12. Contreras F., Pramanik S., Rozhkova A.M., Zorov I.N., Коrotkova O., Sinitsyn A.P., Schwaneberg U., Davari M.D. Engineering robust cellulases for tailored lignocellulosic degradation cocktails, Int.J.Mol.Sci., 2020, v.21, 1589, doi:103390/ijms21051589
13. Dotsenko A.S., Dotsenko G.S., Rozhkova A.M., Zorov I.N., Sinitsyn A.P. Rational design and structure insights for thermostability improvement of Penicillium verruculosum Cel7A cellobiohydrolase, Biochimie, 176, 103-109
14. Contreras F., Thiele M.J., Pramanik S., Rozhkova A., Dotsenko A., Zorov I., Sinitsyn A., Davari M.D., Schwaneberg U. KnowVolution of a GH5 Cellulase from Penicillium verruculosum to Improve Thermal Stability for Biomass Degradation, ACS Sustainable Chemistry and Engineering, 2020, https://dx.doi.org/10.1021/acssuschemeng.0c02465
15. Karp S.G., Osipov D.O., Semenova M.V., Rozhkova A.M., Zorov I.N., Sinitsyna O.A., Soccol C.R., Sinitsyn A.P. Effect of novel Penicillium verruculosum enzyme preparations on the saccahrification of acid- and alkali-pretreated agro-industrial residues. Agronomy, 2020, 10, 1348, doi:10.3390/agronomy10091348
16. Osipov D.O., Dotsenko G.S., Sinitsyna O.A., Kondratieva E.G., Zorov I.N., Shashkov I.A., Satrutdinov A.D., Sinitsyn A.P. Comparative study of the convertibility of agricultural residues and other cellulose-containing materials in hydrolysis with Penicillium verruculosum cellulase. Agronomy, 2020, 10, 1712; doi:10.3390/agronomy10111712
17. Синицын А.П., Синицына О.А., Зоров И.Н., Рожкова А.М.  Возможности экспрессионной системы гриба Penicillium verruculosum для получения продуцентов ферментов, обеспечивающих эффективную деструкцию возобновляемой растительной биомассы (Обзор). Прикладная биохимия и микробиология, 2020, т.56, вып.6, с.551-560
18. Синицын А.П., Синицына О.А., Рожкова А.М. Возможности экспрессионной системы гриба Penicilliumverruculosum для получения промышленно важных ферментов (Обзор), Биотехнология, 2020, Т.36, №6, C. 24-41, doi: 10.21519/0234-2758-2020-36-6-24-41
19. Синицын А.П., Синицына О.А. Биоконверсия возобновляемой растительной биомассы на примере биоэтанола: сырьё, предобработка, ферменты, процессы, экономика (Обзор), Успехи биологической химии, 2021, т.61, с.347-414
20. Рожкова А.М., Кислицин В.Ю. Редактирование геномов мицелиальных грибов: Применение системы CRISPR/CAS (обзор), Успехи биологической химии, 2021, т.61, с.253-294
21. Karp S.G., Rozhkova A.M., Semenova M.V., Osipov D.O., de Pauli S.T.Z., Sinitsyna O.A., Zorov I.N., de Souza Vandenberghe L.P., Soccol C.R., Sinitsyn A.P., Enzyme cocktails from Penicillium verruculosum, Penicillium canescens and Aspergillus spp. for the effective saccharification of agro-industrial wastes, Bioresource Technology, 2021, 124888, doi.org/10.1016/j.biortech.2021.124888
22. Sinelnikov I.G., Siedhoff N.E., Chulkin A.M., Zorov I.N., Schwaneberg U., Davari M.D., Sinitsyna O.A., Shcherbakova L.A., Sinitsyn A.P., Rozhkova A.M. Expression and refolding of the plant chitinase from Drosera capensis for applications as a sustainable and integrated pest management, Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2021, V.9, doi:10.3389/fbioe.2021.728501
23. Pramanik S., Semenova M.V., Rozhkova A.M., Zorov I.N., Korotkova O.G., Sinitsyn A.P., Dvarai M.D. An engineered cellobiohydrolase I for sustainable degradation of lignocellulosic biomass, Biotechnology and Bioengineering, 2021, v.118, p.4014-4027, doi.org/10.1002/bit.27877
24. Dotsenko A.G., Denisenko Yu.A., Rozhkova A.M., Zorov I.N., Shashkov I.A. Implementation of microfiltration in recycled usage of ionic liquid BmimCl and deep eutectic solvent ChCl/acetic acid for biomass conversion, Bioresource Technology Reports, 2022, 17, 100887, doi.org/10.1016/j.biteb.2021.100887
25. Kislitsin V.Yu, Chulkin A.M., Zorov I.N., Denisenko Yu.A., Shashkov I.A., Sinitsyn A.P., Rozhkova A.M. The effect of cellobiohydrolase 1 gene knockout for composition and hydrolytic activity of the enzyme complex secreted by filamentous fungus Penicillium verruculosum, Bioresource Technoloogy Reports, 2022, 18, 101023

1. Разработка штаммов промышленно значимых микроорганизмов
2. Выделение, очистка и характеризация белков для нужд промышленной биотехнологии
3. Анализ и идентификация микробных метаболитов, компонентов растительного и животного сырья
4. Обучение и оказание научно-консультационных услуг