Ключевые слова
молекулярная микробиология, геномика микроорганизмов, метагеномика, геномика растений, биотехнологии, генетическая инженерия, фермент, вирусы растений, вакцина, нанобиотехнологии, высокопроизводительное секвенирование

Направления исследований

• Изучение особенностей структуры, эволюции и экспрессии геномов экстремофильных и биотехнологически значимых микроорганизмов методами высокопроизводительной геномики
• Метагеномный анализ микробных сообществ
• Идентификация и характеристика новых ферментов для биотехнологии и биомедицины
• Изучение структуры и эволюции геномов растений в результате секвенирования и анализа ядерных и органелльных геномов
• Разработка рекомбинантных вакцин на основе нанобиотехнологических подходов
• Разработка методов получения в растениях вакцинных белков возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных («растения-биофабрики»)

Основные методы исследований
Уникальные/редкие методы исследования (на базе собственного оборудования), имеющиеся в лаборатории:
— Высокопроизводительное секвенирование метагеномов, геномов и транскриптомов микроорганизмов и растений, анализ данных методами биоинформатики.

Методы фундаментальных исследований:

• методы генетической инженерии микроорганизмов (бактерии Escherichia coli, дрожжи):  клонирование, гетерологичная экспрессия генов, мутагенез и т.п.
• молекулярно-биологические методы (выделение и анализ ДНК, РНК и белков и т.п.)
• характеристика наноразмерных частиц и белковых комплексов методами атомно-силовой микроскопии
• экспрессия рекомбиантных белков в растениях с помощью фитовирусных векторов

Краткая история отдела
Лаборатория систем молекулярного клонирования была создана в 1992 году при организации Центра «Биоинженерия» РАН. С 1999 года руководителем подразделения является д.б.н., профессор Н.В. Равин.

В 2014 году из состава лаборатории в качестве самостоятельного научного подразделения была выделена группа геномики микроорганизмов (рук. д.б.н. А.В. Марданов) и организован Отдел молекулярной биологии микроорганизмов, включающий эту группу и Лабораторию систем молекулярного клонирования. В 2017г группа геномики микроорганизмов преобразована в Лабораторию геномики микроорганизмов и метагеномики.

ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

• Определен механизм репликации линейной ДНК с ковалентно замкнутыми теломерами у прокариот. Определена структура генома уникального объекта — бактериофага N15, который в лизогенном состоянии не интегрируется в хромосому E. coli, а представляет собой линейную плазмиду c ковалентно замкнутыми концами (теломерами). На примере N15 предложена и впервые в мире экспериментально доказана модель репликации линейной ДНК с ковалентно замкнутыми теломерами: двунаправленная репликация инициируется с внутреннего ori сайта, после дупликации теломер идентифицированный нами специальный фаговый фермент, протеломераза, обеспечивающий образование ковалентно замкнутых теломер, разрезает эти последовательности, что приводит к  образованию двух дочерних линейных молекул. Этот механизм специфичен для прокариот и отличается от механизма репликации ДНК поксвирусов и других эукариотических репликонов с ковалентно замкнутыми теломерами.
• Определены полные нуклеотидные последовательности геномов более 20 экстремофильных микроорганизмов, в том числе десяти термофильных архей, что стало основой работ по молекулярно-генетической, микробиологической, биохимической и экологической характеристике этих микроорганизмов. Геномные данные позволили определить пути метаболизма микроорганизмов различных групп, особенности механизма репликации ДНК, исследовать механизмы эволюции геномов на молекулярном уровне, определить экологическую роль, которую изучаемые микроорганизмы могут играть в природных сообществах. Проведена  функциональная характеристика ряда ферментов архей, представляющих интерес для фундаментальных исследований (ДНК-лигазы архей как модель ДНК-лигаз эукариот) или перспективных для решения биотехнологических задач.
• Проведена крупномасштабная характеристика биоразнообразия микроорганизмов уникальной экологической ниши — термальных источников кальдеры вулкана Узон (Камчатка). Для молекулярной идентификации микроорганизмов был использован метод параллельного пиросеквенирования фрагментов генов 16S рРНК, позволяющий проводить одновременный анализ десятков тысяч независимых последовательностей и получать количественные данные о составе сообщества. Установлены закономерности изменения степени разнообразия и состава сообществ в зависимости от температуры и химического состава воды, идентифицированы новые группы термофильных бактерий и архей.
• Методами высокопроизводительной геномики определен состав сообществ микроорганизмов мест залегания гидратов метана в озере Байкал. Структура микробных сообществ свидетельствует о биогенном происхождении гидратов.
• Разработаны новые эффективные методы продукции в растениях вакцинных белков возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных. Высокий уровень продукции рекомбинантных белков в растениях достигается за счет использования системы экспрессии, основанной на рекомбинантных вирусах растений. Разработана кандидатная «растительная» противогриппозная вакцина на основе вирусоподобных частиц – носителей высококонсервативного белка М2 вируса гриппа, последовательность которого неизменна у различных штаммов. В экспериментах на животных показана эффективность препарата (100% защита от летальной гриппозной инфекции).
• С участием коллектива лаборатории завершен международный проект по расшифровке генома картофеля. Роль лаборатории систем молекулярного клонирования состояла в секвенировании библиотеки ВАС клонов 12-ой хромосомы и аннотации полученных последовательностей.
• Определена полная нуклеотидная последовательность генома и транскриптома термотолерантных метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha DL1. Полученные результаты создают основу для разработки биотехнологических платформ экспрессии рекомбинантных белков в H. polymorpha DL1, а также процессов, предполагающих направленную модификацию штамма методами биоинженерии и метаболической инженерии.
• Разработана кандидатная противогриппозная нановакцина на основе М2е пептида вируса гриппа, экспонированного на поверхности вирусоподобных наночастиц. Получен гибридный белок, в котором в состав НВс антигена вируса гепатита В в район поверхностной иммунодоминантной петли включено 4 копии последовательности М2е пептида вируса гриппа А человека. Установлено, что иммунизация мышей препаратами химерных вирусоподобных частиц вызывает эффективный иммунный ответ против М2е и защищает их от летальной инфекции различными штаммами вируса гриппа. Разработанная кандидатная противогриппозная вакцина успешно прошла доклинические исследования в ФГБУ «НИИгриппа» Минздрава.
• C участием коллектива отдела завершен международный проект по секвенированию генома пшеницы. Последовательность генома, представленная в виде  21-ой хромосомы, является наиболее полным и качественно собранным геномом пшеницы на сегодняшний день. Наш коллектив выполнял работы по секвенированию и сборке последовательности хромосомы 5BS. Наличие высококачественной последовательности генома ускорит селекцию пшеницы в течение следующих десятилетий, проложит путь для создания новых сортов пшеницы, лучше адаптированных к неблагоприятным климатическим условиям, с более высокими урожаями, улучшенными питательными свойствами и устойчивостью к болезням. Статья «Shifting the limits in wheat research and breeding using a fully annotated reference genome» опубликована в журнале Science (2018, 361: eaar7191361).
• Определены последовательности геномов бактерий —  первых культивированных представителей кандидатного филума TG3. На основе полногеномных данных определено филогенетическое положение этих микроорганизмов как двух новых классов в Fibrobacteres и проведена реконструкция путей их метаболизма.
• В результате секвенирования метагенома микробного сообщества термальных вод, залегающих на глубине около 2 км в Западной Сибири, получено 25 геномов, представляющих доминирующие линии микроорганизмов. Впервые определена полная последовательность генома бактерии некультивируемого кандидатного филума BRC1 и последовательности геномов некультивируемых линий филумов Riflebacteria и Aminicenantes. На основе геномных данных, без культивирования микроорганизмов, определено филогенетическое положение новых бактерий, охарактеризованы пути их метаболизма и функциональная роль в микробном сообществе Построена модель биогеохимических процессов в подземном водном резервуаре.
• В результате метагеномного анализа и секвенирования геномов единичных клеток из подземных термальных вод Западной Сибири, изолированных от поверхности на протяжении десятков миллионов лет, обнаружено исключительно высокое генетическое сходство (идентичность нуклеотидных последовательностей выше 99.99%) штаммов бактерий Desulforudis audaxviator из подземных экосистем в Сибири, Южной Африке и США. Эти данные указывают на низкую скорость эволюции в подземных экосистемах и/или неизвестные пути распространения таких микроорганизмов.

За последние 10 лет в сотрудниками подразделения защищены 2 докторские и 8 кандидатских диссертаций. В отделе выполняются гранты Российского научного фонда, проекты по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Минобрнауки России, 7-ой рамочной программы ЕС, РФФИ и других научных фондов.

Сотрудники лаборатории были удостоены Премии  Европейской Академии для молодых ученых России по разделу «Биология» (2011), Премией Фонда поддержки науки имени академика В.Е. Соколова для молодых ученых (2011), Премией правительства Москвы молодым ученым за 2013 год в номинации «Биология и медицинские науки», и медалью Российской академии наук для молодых ученых по направлению «Физико-химическая биология» за 2017 г.

СОСТАВ ОТДЕЛА

ИННОВАЦИОННЫЕ РАЗРАБОТКИ

УНИКАЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

1. Ravin N.V., Ravin V.K. Use of a linear multicopy vector based on the mini-replicon of temperate coliphage N15 for cloning DNA with abnormal secondary structures. — Nucleic Acids Research, 1999, 27, 13
2. Ravin N., Svarchevsky, A., Deho G. The antiimunity system of phage-plasmid N15: identification of the antirepressor gene and its control by a small processed RNA. — Molecular Microbiology, 1999, 34: 980-994
3. Ravin V., Ravin N., Casjens S., Ford M., Hatfull G., & Hendrix R. Genomic sequence and analysis of the atypical bacteriophage N15. — J. Mol. Biol., 2000, 299, 53-73
4. Ravin, N.V., Kuprianov, V.V., Gilcrease, E.B., & Casjens, S.R. Bidirectional replication from an internal ori site of the linear N15 plasmid prophage. — Nucleic Acids Research, 2003, 31, 6552-6560
5. Mardanov A.V., Ravin N.V., Svetlitchnyi V.A., Beletsky A.V., Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A., Skryabin K.G. Metabolic versatility and indigenous origin of the archaeon Thermococcus sibiricus, isolated from a Siberian oil reservoir, as revealed by genome analysis. — Appl. Environ. Microbiol., 2009, 75,  4580-4588
6. Godiska R., Mead D., Dhodda V., Wu C., Hochstein R., Karsi A., Usdin K., Entezam A., Ravin N. Linear plasmid vector for cloning of repetitive or unstable sequences in Escherichia coli. — Nucleic Acids Res, 2010, 38(6), e88
7. Potato Genome Sequencing Consortium, Xu X., Pan S., Cheng S., Zhang B., Mu D., Ni P., Zhang G., Yang S., Li R., Wang J., Orjeda G., Guzman F., Torres M., Lozano R., Ponce O., Martinez D., De la Cruz G., Chakrabarti S.K., Patil V.U., Skryabin K.G., Kuznetsov B.B., Ravin N.V., Kolganova T.V., Beletsky A.V., Mardanov A.V., Di Genova A., Bolser D.M., Martin D.M., Li G., Yang Y., Kuang H., Hu Q., Xiong X., Bishop G.J., Sagredo B., Mejía N., Zagorski W., Gromadka R., Gawor J., Szczesny P., Huang S., Zhang Z., Liang C., He J., Li Y., He Y., Xu J., Zhang Y., Xie B., Du Y., Qu D., Bonierbale M., Ghislain M., Herrera M.del R., Giuliano G., Pietrella M., Perrotta G., Facella P., O’Brien K., Feingold S.E., Barreiro L.E., Massa G.A., Diambra L., Whitty B.R., Vaillancourt B., Lin H., Massa A.N., Geoffroy M., Lundback S., Della Penna D., Buell C.R., Sharma S.K., Marshall D.F., Waugh R., Bryan G.J., Destefanis M., Nagy I., Milbourne D., Thomson S.J., Fiers M., Jacobs J.M., Nielsen K.L., Sønderkær M., Iovene M., Torres G.A., Jiang J., Veilleux R.E., Bachem C.W., de Boer J., Borm T., Kloosterman B., van Eck H., Datema E., Hekkert B.L., Goverse A., van Ham R.C., Visser R.G. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. — Nature, 2011, 475(7355), 189-195
8. Kadnikov VV, Mardanov AV, Beletsky AV, Shubenkova OV, Pogodaeva TV, Zemskaya TI, Ravin NV, Skryabin KG. Microbial community structure in methane hydrate-bearing sediments of freshwater Lake Baikal. — FEMS Microbiol Ecol. 72012, 9, 348-358
9. Podosokorskaya O.A., Kadnikov V.V., Gavrilov S.N., Mardanov A.V., Merkel A.Y., Karnachuk O.V., Ravin N.V., Bonch-Osmolovskaya E.A., Kublanov I.V. Characterization of Melioribacter roseus gen. nov., sp. nov., a novel facultatively anaerobic thermophilic cellulolytic bacterium from the class Ignavibacteria, and a proposal of a novel bacterial phylum Ignavibacteriae. — Environ. Microbiol., 2013, 15(6): 1759-1571
10. Ravin NV, Eldarov MA, Kadnikov VV, Beletsky AV, Schneider J, Mardanova ES, Smekalova EM, Zvereva MI, Dontsova OA, Mardanov AV, Skryabin KG. Genome sequence and analysis of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha DL1. — BMC Genomics, 2013, 14(1): 837
11. Blokhina E.A., Kuprianov V.V., Tsybalova L.M., Kiselev O.I., Ravin N.V., Skryabin K.G. A molecular assembly system for presentation of antigens on the surface of HBc virus-like particles. — Virology, 2013, 435, 293-300
12. Sorokin DY, Gumerov VM, Rakitin AL, Beletsky AV, Damsté JS, Muyzer G, Mardanov AV, Ravin NV. Genome analysis of Chitinivibrio alkaliphilus gen. nov., sp. nov., a novel extremely haloalkaliphilic anaerobic chitinolytic bacterium from the candidate phylum Termite Group 3. — Environ Microbiol., 2014, 16(6):1549-65
13. Pezeshgi Modarres H, Dorokhov BD, Popov VO, Ravin NV, Skryabin KG, Dal Peraro M. Understanding and engineering thermostability in DNA ligase from Thermococcus sp. 1519. — Biochemistry, 2015, 54(19):3076-85
14. Ravin NV, Blokhina EA, Kuprianov VV, Stepanova LA, Shaldjan AA, Kovaleva AA, Tsybalova LM, Skryabin KG. (2015) Development of a candidate influenza vaccine based on virus-like particles displaying influenza M2e peptide into the immunodominant loop region of hepatitis B core antigen: Insertion of multiple copies of M2e increases immunogenicity and protective efficiency. – Vaccine, 2015, 33(29):3392-3397
15. Mardanova ES, Kotlyarov RY, Kuprianov VV, Stepanova LA, Tsybalova LM, Lomonosoff GP, Ravin NV. Rapid high-yield expression of a candidate influenza vaccine based on the ectodomain of M2 protein linked to flagellin in plants using viral vectors. — BMC Biotechnology, 2015, 15: 42
16. Mardanov AV, Panova IA, Beletsky AV, Avakyan MR, Kadnikov VV, Antsiferov DV, Banks D, Frank YA, Pimenov NV, Ravin NV, Karnachuk OV. Genomic insights into a new acidophilic, copper-resistant Desulfosporosinus isolate from the oxidized tailings area of an abandoned gold mine. — FEMS Microbiol Ecol, 2015, 92(8): fiw111.
17. Ravin N.V., Gruzdev E.V., Beletsky A.B., Mazur A.M., Prokhortchouk E.B., Filyushin M.A.,  Kochieva E.Z., Kadnikov V.V., Mardanov A.B., Skryabin K.G. The loss of photosynthetic pathways in the plastid and nuclear genomes of the non-photosynthetic mycoheterotrophic eudicot Monotropa hypopitys. — BMC Plant Biology, 2016, 16: 929.
18. Mardanova E.S., Blokhina E.A., Tsybalova L.M., Peyret H., Lomonossoff G.P., Ravin N.V. Efficient transient expression of recombinant proteins in plants by the novel pEff vector based on the genome of Potato Virus X. — Front. Plant Sci. 2017, 8: 247
19. Ravin NV, Rakitin AL, Ivanova AA, Beletsky AV, Kulichevskaya IS, Mardanov AV, Dedysh SN. Genome analysis of Fimbriiglobus ruber SP5T, a planctomycete with confirmed chitinolytic capability. — Appl Environ Microbiol., 2018, 84: e02645-17.
20. Kadnikov VV, Mardanov AV, Ivasenko DA, Antsiferov DV, Beletsky AV, Karnachuk OV, Ravin NV. Lignite coal burning seam in the remote Altai Mountains harbors a hydrogen-driven thermophilic microbial community. — Sci Rep., 2018, 8(1): 6730.
21. Eldarov MA, Beletsky AV, Tanashchuk TN, Kishkovskaya SA, Ravin NV and Mardanov AV Whole-genome analysis of three yeast strains used for production of sherry-like wines revealed genetic traits specific to flor yeasts. — Front. Microbiol., 2018, 9: 965.
22. International Wheat Genome Sequencing Consortium, Appels R, Eversole K,….Ravin N, Ravin N, Skryabin K, Beletsky A, Kadnikov V, Mardanov A, Nesterov M, Rakitin A,….Uauy C. Shifting the limits in wheat research and breeding using a fully annotated reference genome. — Science, 361(6403): pii: eaar7191.
23. Kadnikov VV, Mardanov AV, Beletsky AV, Banks D, Pimenov NV, Frank YA, Karnachuk OV, Ravin NV. A metagenomic window into the 2-km-deep terrestrial subsurface aquifer revealed multiple pathways of organic matter decomposition. — FEMS Microbiol Ecol, 2018, 94(10): fiy152.
24. Kadnikov VV, Mardanov AV, Beletsky AV, Rakitin AL, Frank YA, Karnachuk OV, Ravin NV. Phylogeny and physiology of candidate phylum BRC1 inferred from the first complete metagenome-assembled genome obtained from deep subsurface aquifer. — Syst Appl Microbiol., 2019, 42(1): 67-76.
25. Karnachuk OV, Frank YA, Lukina AP, Kadnikov VV, Beletsky AV, Mardanov AV, Ravin NV. Domestication of previously uncultivated Candidatus Desulforudis audaxviator from a deep aquifer in Siberia sheds light on its physiology and evolution. — ISME J, 2019, 13(8): 1947-1959.
26. Gruzdev EV, Kadnikov VV, Beletsky AV, Kochieva EZ, Mardanov AV, Skryabin KG, Ravin NV. (2019) Plastid genomes of carnivorous plants Drosera rotundifolia and Nepenthes × ventrata reveal evolutionary patterns resembling those observed in parasitic plants —  Int. J. Mol. Sci. 2019, 20: 4107.
27. Gruzdev EV, Kadnikov VV, Beletsky AV, Mardanov AV, Ravin NV. Extensive plastome reduction and loss of photosynthesis genes in Diphelypaea coccinea, a holoparasitic plant of the family Orobanchaceae — PeerJ., 2019, 7: e7830.
28. Mardanov AV, Beletsky AV, Ravin NV, Botchkova EA, Litti YV, Nozhevnikova AN. Genome of a novel bacterium «Candidatus Jettenia ecosi» reconstructed from the metagenome of an anammox bioreactor —  Front Microbiol. 2019, 10: 2442.
29. Blokhina EA, Mardanova ES, Stepanova LA, Tsybalova LM, Ravin NV. Plant-produced recombinant influenza A virus candidate vaccine based on flagellin linked to conservative fragments of M2 protein and hemagglutintin — Plants (Basel). 2020, 9(2): E162.
30. Kadnikov VV, Mardanov AV, Beletsky AV, Karnachuk OV, Ravin NV. (2020) Complete genome of a member of a new bacterial lineage in the Microgenomates group reveals an unusual nucleotide composition disparity between two strands of DNA and limited metabolic potential —  Microorganisms. 2020, 8(3): E320.