Ключевые слова
биоэнергетика, митохондрии, апоптоз, митофагия, дрожжи, длинноволновые формы  хлорофилла, П700, нефотохимическое тушение  и миграция энергии, фотостабильность фотосистем, антенна и реакционные центры, стрессовые светоиндуцируемые белки, хлоропласты, цианобактерии

Направления исследований

• Регуляция функционирования и биогенеза фотосинтетического аппарата растений и цианобактерий
• Нефотохимическое тушение флуоресценции фикобилисом цианобактерий каротиноидсодержащим белком ОСР
• Механизм изменения состояния  фотосинтетического аппарата цианобактерий в зависимости от редокс состояния переносчиков электронов между фотосистемами (состояние 1 –состояние 2 фотосинтетического аппарата)
• Природа длинноволновых форм хлорофилла антенны ФС1цианобактерий и их роль в функционировании реакционного центра П700 и диссипации избыточно поглощенной энергии
• Роль свето-индуцируемых стрессовых белков цианобактерий в защите фотосинтетического аппарата от фотодеструкции
• Молекулярные механизмы фотостабильности и термостабильности фотосистемы 1 цианобактерий
• Поиск возможных условий индукции неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий в связи с апоптозом
• Использование митохондрий для выяснения механизма действия биологически активных соединений
• Выявление роли митохондрий в жизненно важных клеточных (апоптоз, митофагия) и организменных (старение) процессах
• Определение роли митохондрий в адаптации к экстремальным условиям

Основные методы исследований

• характеристика флуоресценции интактных клеток и фотоиндуцированного изменения поглощения реакционного центра фотосистемы 1(П700) цианобактерий при помощи флуориметра РАМ-101 (Walz, Германия) в комплекте с приставкой ED-P700 DW-101
• разработан метод выделения тилакоидных мембран и фракционирования хлорофилл-белковых комплексов цианобактерий
• в лаборатории выделены уникальные штаммы дрожжей, способные расти в экстремальных условиях (при очень кислых и щелочных значениях рН, при повышенной концентрации соли)
• собрана уникальная коллекция дрожжевых организмов, охватывающая весь спектр вариантов энергетического обмена дрожжей
• создана собственная база данных о компонентах и метаболических реакциях разных компартментов дрожжевых митохондрий
• разработан метод выделения супер-сопряженных дрожжевых митохондрий и митохондрий печени крысы, не только отвечающих всем известным критериям физиологической интактности, но и имеющих рекордные величины дыхательного контроля (показателя прочности сопряжения дыхания и фосфорилирования)
• для оценки степени интактности выделенных препаратов митохондрий лаборатория использует помимо классических методов, свои собственные тесты (отсутствие шунтирования компонентов дыхательной цепи, сохранность пула Mg(2+) и аденилаткиназы, локализованных в межмембранном пространстве, сукцинат-цитохром с-редуктазная активность и др.)
• была создана комплексная система тестирования влияния биологически-активных веществ на энергетику выделенных митохондриальных препаратов
• для исследования ингибирования синтеза ATP лаборатория использует два независимых метода: изменение рН при добавлении ADP к среде, дополненной Phenol Red (Beckman caulter Du 650) и определение синтеза NADPH (340 нм) при добавлении ADP к среде, дополненной глюкозой, гексокиназой и глюко-6-фосфатдегидрогеназой (Cary 300 bio UV-visible)
• для изучения ингибирования гидролиза ATP лаборатория пользуется тремя независимыми методами (восстановление мембранного потенциала митохондриями при добавлении  ATP к среде, лишенной окисляемых субстратов; изменение рН при добавлении  ATP к среде, лишенной окисляемых субстратов, но дополненной Phenol Red; уменьшение уровня NADH при добавлении ATP к среде, лишенной окисляемых субстратов, но дополненной фосфоэнолпируватом, пируваткиназой и лактатдегидрогеназой)
• разработан метод быстрого (препаративного) выделения гомогенных препаратов нитратредуктаз
• предложены новые дешевые и высокопроизводительные экспресс-методы, пригодные для автоматизированного скрининга мутантных целлобиозодегидрогеназ и целлюлаз.

Методы фундаментальных и прикладных исследований:

• культивирование цианобактерий и использование мутантов цианобактерий (совместно с кафедрой генетики МГУ), определение интенсивности фотосинтеза изотопным методом
• выделение мембран,  очистка мембранных комплексов  фотосистемы 1  биохимическими методами:  френч-пресс, центрифугирование, колоночная хроматография, электрофорез
• измерение кинетики реакций  и спектральных характеристик очищенных белков  методами линейной спектроскопии. Используется дихрограф Chirascanplus (Applied Photophysics, Англия),  спектрофлуориметры RF-5301 (Shimadzu, Япония) и Fluoromax-4 (Horiba, Япония) и спектрофотометр  Сary-300 (Varian, Австралия)
• измерение кинетики реакций  и спектральных характеристик очищенных белков  методами нелинейной  спектроскопии проводятся совместно с Институтом спектроскопии РАН на фемтосекундном спектрометре
• измерение скорости дыхания проводится амперометрически, с помощью закрытого кислородного электрода типа Кларка
• фракционирование пигмент-белковых и белковых комплексов тилакоидных мембран с помощью нативного неокрашенного электрофореза в ПААГ (Clear Native PAGE) и двумерного электрофореза с последующей идентификацией белков с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF
• вестерн-блот анализ стрессовых светоиндуцируемых белков цианобактерий
• регистрация мембранного потенциала митохондриальных препаратов проводится спектрофотометрически (Beckman caulter Du 650), с сафранином О в качестве ΔΨ-зонда
• мембранный потенциал митохондрий в клетке оценивается флюориметрически с помощью Mitotracker Red (флуоресцентный микроскоп Olympus BX51, проточный цитометр FACS-Callibur)
• определение продукции пероксида водорода митохондриальными препаратами оценивается флуориметрически с помощью пероксидазы хрена и Amplex Red (10 ацетил 3,7 дигидроксифеноксазин) (Shimadzu RF-5301PC)
• синтез перекиси водорода митохондриями в клетке оценивается флуориметрически с DCF-DA в качестве зонда (Olympus BX51, FACS-Callibur)
• набухание митохондрий регистрируется на спектрофотометре Hitachi-557 при 540 нм
• жизнеспособность клеток определяется двумя независимыми методами: проточной цитометрии (или флуоресцентной микроскопии) с пропидиум иодидом и по числу выросших на полноценной агаризованной среде колоний после разведения клеточной суспензии в 100 ‒ 1000 раз
• фрагментация ДНК клетки выявляется с помощью проточного цитометра или флуориметрически
• конденсация хроматина детектируется методом проточной цитометрии, используя систему из красителей YO-PRO®-1 Iodide и Propidium Iodide.

Краткая история лаборатории
Лаборатория Биоэнергетики образована в 2013 г. из сотрудников лаборатории биологического окисления  (проф. Р.А. Звягильская) и лаборатории биохимии хлоропластов (проф. Н.В. Карапетян). Лаборатория биологического окисления была организована одновременно с Институтом в 1935 г. Ее работой последовательно руководили академик А.Н. Бах, проф. Д.М. Михлин, проф. А.В. Котельникова и проф. Р.А. Звягильская. Лаборатория биохимии хлоропластов была организована в 1986 г. из сотрудников лаборатории фотобиохимии (акад. A.A.Красновский) и лаборатории энзимологии (акад. H.М. Сисакян).

ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

К достижениям лаборатории можно отнести:

1. Получены приоритетные данные о необходимости каротиноидов в качестве структурных компонентов для формирования функциональной фотосистемы 2 зеленых растений
2. Впервые идентифицирован каротиноид, входящий в состав каротиноидсодержащего белка ОСР, участвующего в тушении флуоресценции фикобилисом цианобактерий; показана кинетическая неоднородность тушения флуоресценции при участии ОСР
3. У Arthrospira platensis в фотосистеме 1 идентифицированы две спектрально различные длинноволновые формы хлорофилла  (флуоресцирующие при 726 и 760 нм), которые в зависимости от редокс состояния реакционного центра переносят энергию возбуждения от антенного хлорофилла  к реакционному центру,  а также участвуют в диссипации избыточно поглощенной энергии
4. Показано, что тушение флуоресценции фотосистемы 2 при изменении состояний фотосинтетического аппарата цианобактерий регулируется скоростью линейного переноса электронов в акцепторной части этой фотосистемы через изменение редокс состояния первичного и вторичного хиноновых акцепторов QA и QB
5. Выявлена ассоциация светоиндуцируемых стрессовых HliA/HliB белков как с фотосистемой 1, так и с комплексом фотосистемы 2, что предполагает универсальную роль этих белков в защите фотосинтетического аппарата от избыточного света
6. Из нового гриба-продуцента выделена и охарактеризована нейтральная целлобиозодегидрогеназа, участвующая в сопряженном процессе модификации целлюлозы и лигнина, секвенирован ее ген, клонирована кДНК, определена первичная и смоделирована пространственная структура
7. Исследованы особенности энергетического обмена дрожжей и дрожжеподобных организмов, в том числе впервые – терма-, соле- и рН-толерантных штаммов. Выявлены масштабы вариабельности энергетического статуса дрожжевых клеток. Впервые доказано, что эффективность процесса окислительного фосфорилирования в митохондриях дрожжей может быть столь же высокой, как и у митохондрий высших эукариот. Сформулированы концепции о моделях энергетического обмена дрожжей и экономизации энергетического обмена при одно- и многофакторном лимитировании роста клеток. Выявлены особенности энергизации дрожжевых митохондрий. Впервые обнаружена способность митохондрий дрожжей (Endomyces magnusii) эффективно осуществлять энергозависимое поглощение Ca(2+) по механизму унипорта. Выявлены физиологические активаторы транспорта Ca(2+). Охарактеризована система Na(+)-независимого выхода Ca(2+) из митохондрий дрожжей, ее регуляция (активаторы и ингибиторы)
8. Совместно со шведскими коллегами исследованы системы транспорта фосфата (Pн) клетками выделенного штамма дрожжей Yarrowia lipolytica, способного расти в широком диапазоне рН, в том числе и при щелочных значениях рН. Впервые показано, что дрожжи обладают не только активной сопряженной с переносом Н(+) системой транспорта Pн, но и высокоэффективной, регулируемой Na(+)-зависимой системой транспорта Pн. Исследованы кинетические свойства обеих систем, регуляция, относительный вклад при росте клеток при различных значениях рН
9. Исследована топография активного центра дикарбоксилатного переносчика в митохондриях печени. С этой целью синтезированы производные малоновой кислоты (ингибитора переносчика) и определена энергия взаимодействия различных участков линейного гидрофобного зонда с активным центром переносчика. Предполагается, что обнаруженные зоны в активном центре являются элементами его воротного механизма. Разработан полярографический метод измерения транспорта ионов через липосомальную мембрану. Разработана методика изучения дикарбоксилатного транспортера цитоплазматической мембраны дрожжей Sacharomyces cerevisiae in vivo. Определены субстратная специфичность и кинетические параметры этого переносчика, найден его специфический конкурентный ингибитор. Показана зависимость транспорта этим переносчиком от ΔpH на мембране
10. Идентифицированы мутанты метилотрофных дрожжей Pichia methanolica, несущих различные нарушения транслокации и сборки мультимерных ферментативных комплексов пероксисомального матрикса
11. Доказано существование нового класса нитратредуктаз, несодержащих молибден или молибдокофактор в активном центре. Совместно с лабораторией «Инженерной энзимологии» получены кристаллы нитритредуктазы из Thioalkalivibrio nitratireducens, расшифрована ее структура с разрешением 1,3 Е, определены ее первичная структура, физико-химические и кинетические свойства
12. На прочносопряженных и деэнергизованных митохондриях дрожжей Y. lipolytica и D. magnusii проверены все условия, способствующие индукции неспецифической проницаемости в митохондриях животных и растений и сделан общий вывод, что дрожжевые митохондрии лишены Сa(2+)-зависимой пермеабилизации
13. Впервые в митохондриях дрожжей Y. lipolytica и D. magnusii обнаружен ATP-зависимый К(+)-канал «животного типа», закрываемый ATP и другими «закрывателями» ATP-зависимого К(+)-канала митохондрий животных (mitoK(+)ATP) и открываемого его индукторами и изучена его регуляция
14. Разработан метод выделения суперсопряженных митохондрий из печени крысы, что позволяет получить большое количества митохондрий высокого качества
15. Разработана комплексная система тестирования влияния физиологически активных соединений на митохондрии, включающая не только анализ скорости дыхания и величины мембранного потенциала, но и анализ редокс-статуса митохондрий, возможных путей транспорта соединения, влияния на синтез и гидролиз ATP, на открытие ATP-зависимого K(+)-канала и Cа(2+)/Pн-зависимой неспецифической поры, на скорость транспорта Cа(2+), антиоксидантное или прооксидантное действие, детергентное действие
16. Построены трехмерные модели двух мембранных белков, в том числе и (впервые) дрожжевой митохондриальной альтернативной оксидазы с использованием современного арсенала биоинформатики.

СОСТАВ ЛАБОРАТОРИИ

УНИКАЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

1. Акулинкина Д.В., Болычевцева Ю.В., Еланская И.В., Карапетян Н.В., Юрина Н.П. Ассоциация светоиндуцируемых стрессовых белков HliA/HliB с тримерами и мономерами фотосистемы 1 в клетках цианобактерии Synechocystis PCC 6803. Биохимия, 2015. Т.80. №10. с. 1522-1531.
2. Болычевцева Ю.В., Кузьминов Ф.И., Еланская И.В., Горбунов М.Ю., Карапетян Н.В. Активность фотосистем и переходные состоянии фотосинтетического аппарата мутантов Synechocystis PCC 6803 с различным редокс состоянием пластохинонового пула. Биохимия. 2015. Т. 80. (1). С. 65 – 78.
3. Рогов А.Г,  Звягильская Р.А. Физиологическая роль митохондриальной альтернативной оксидазы (от дрожжей до растений). Биохимия. 2015. т. 80 (4). С. 472-479.
4. Рогов А.Г., Тренделева Т.А., Аливердиева Д.А., Звягильская Р.А. Еще раз о взаимодействии бутилового эфира родамина 19 с митохондриями печени крысы. Биохимия. 2016. 81(4). С. 585-593.
5. Волошина О.В., Болычевцева Ю.В., Кузьминов Ф.И., Горбунов М.Ю., Еланская И.В., Фадеев В.В. Активность фотосистемы II дикого типа Synechocystis PCC 6803 и его мутантов с различным редокс состоянием пластохинонового пула, Биохимия, 2016, 81(8), 1093-1108.
6. Юрина Н.П., Одинцова М.С. Геномы митохондрий фотосинтезирующих эукариот. Биохимия. 2016, 81(2), 191-205.
7. Chankova S., Yurina N. Chloroplast heat shock protein 70B as marker of oxidative stress. In: Heat Shock Proteins and Plants. Springer. Eds: A.A.A. Asea, S.K. Calderwood, P.Kaur. Heat Shock Proteins. 2016. V.10, Chapter 9, P.169-188. DOI 10.1007/978-3-319-46340-7.
8. Vladimir V. Shubin , Irina V. Terekhova,  Yulia V. Bolychevtseva,  Eithar El-Mohsnawy,  Matthais Rögner , Werner Mäntele, Marta J. Kopczak, Enela Džafić.  Thermostability of Photosystem I trimers and monomers from the cyanobacterium Thermosynechococcus elongates Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 2017. V. 179. P. 17–22.
9. R. Yu. Pishchalnikov, V. V. Shubin, and A. P. Razjivin. Spectral Differences between Monomers and Trimers of Photosystem I Depend on the Interaction between Peripheral Chlorophylls of Neighboring Monomers in Trimer. Physics of Wave Phenomena. 2017. V. 25, No. 3, pp. 185–195. Allerton Press, Inc., 2017.
10. Юрина Н.П., Шарапова Л.С., Одинцова М.С. Геномы пластид фотосинтезирующих эукариот. Биохимия. 2017. Т.82. №6. с.900-915.
11. Yurina N.P., Popov V.O., Krasnovsky A.A., Govindjee. Remembering Navasard V. Karapetyan (1936-2015). Photosynth Res. 2017; 132(3), 221-226.
12. Rogov A.G., Ovchenkova A.P., Goleva T.N., Kireev I.I., Zvyagilskaya R.A. (2017). New yeast models for studying mitochondrial morphology as affected by oxidative stress and other factors.  Anal.  Biochem., 2018. V.552. p.24-29.
13. Goleva T., Rogov A., Zvyagilskaya R. (2017) Alzheimer’s Disease: Molecular Hallmarks and Yeast Models. J. Alzheimer’s Disease & Parkinsonism, 2017, 7 (6): 394-401.
14. Рогов А.Г, Голева Т.Н., Овченкова А.П., Аливердиева Д.А, Звягильская Р.А. (2018) Новые данные о действии SkQ1 и SkQT1 на митохондрии печени крысы и клетки дрожжей. Биохимия. 2018. Т. 83(5) c. 724-734.
15. Roman Y. Pishchalnikov, Vladimir V. Shubin, Andrei P. Razjivin The single molecule fluorescence spectroscopy of the PSI from Arthrospira platensis: a computational approach. // Molecules. 2019. V.24(4). E822.
16. Pishchalnikov R. , Shubin V.,  Razjivin  A. Single Molecule Fluorescence Spectroscopy of PSI Trimers from Arthrospira platensis: A Computational Approach. Molecules 2019, 24, 822; doi:10.3390/molecules24040822
17. Шарапова Л.С., Акулинкина Д.В., Болычевцева Ю.В., Еланская И.В.,  Юрина Н.П.  Изучение локализации низкомолекулярных стресс-индуцируемых белков, защищающих фотосинтетический аппарат от фотодеструкции.  Прикладная биохимия и микробиология 2019, том 55, № 1, с. 69–76.
18. Юрина Н.П., Одинцова М.С. Ретроградная сигнальная система хлоропластов.  Физиология растений, 2019, том 66, № 4, с. 243–255.
19. Болычевцева Ю.В., Терехова И.В.,  В. В. Шубин В.В., Юрина Н.П. Термостабильность мономеров и тримеров фотосистемы I цианобактерии Arthrospira platensis. Прикладная биохимия и микробиология. 2019, том 55, № 3, с. 286–292.
20. Zlenko DV, Elanskaya IV, Lukashev EP, Bolychevtseva YV, Suzina NE, Pojidaeva ES, Kononova IA, Loktyushkin AV, Stadnichuk IN. Role of the PB-loop in ApcE and phycobilisome core function in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2019 Feb 1;1860(2):155-166. doi: 10.1016/j.bbabio.2018.10.004. Epub 2018 Nov 7.
21. Rabinovich ML, Melnik MS, Herner ML, Voznyi YV, Vasilchenko LG. Predominant Nonproductive Substrate Binding by Fungal Cellobiohydrolase I and Implications for Activity Improvement. Biotechnology Journal. 2019 Mar;14(3):e1700712.
22. Sharapova L., Oleskina Yu., Yurina N. Stress  high-light-inducible proteins and their localization in the chlorophyll-protein complexes of cyanobacteria. Proceedings 11th Seminar of Ecology – 2018 with international participation 26-27 April 2018. Sofia. Bulgaria. 2019. P. 101-103.  https://seminarofecology.wixsite.com/2018
23. Мамаев Д.В., Звягильская Р.А. (2019) Митофагия у дрожжей (обзор). Успехи биологической химии, 59, 455–472.
24. Goleva T.N., Rogov A.G., Korshunova G.A., Trendeleva T.A., Mamaev D.V., Aliverdieva D.A., Zvyagilskaya R.A. (2019). SkQThy, a novel and promising mitochondria-targeted antioxidant. Mitochondrion. 49:206-216. doi: 10.1016/j.mito.2019.09.001.
25. Rogov A.G., Goleva T.N., Sukhanova E.I., Epremyan K.K., Trendeleva T.A., Ovchenkova A.P., Aliverdieva D.A., Zvyagilskaya R.A.(2020) Mitochondrial Dysfunctions May Be One of the Major Causative Factors Underlying Detrimental Effects of Benzalkonium Chloride. Oxid. Med. Cell. Longev. 2020 Feb 10;2020:8956504. doi: 10.1155/2020/8956504. eCollection 2020.

Публикации 2020-2021 гг.

1. Болычевцева Ю.В., Тропин И.В., Стадничук И.Н. Состояние 1 и 2 в фотосинтетическом аппарате красных микроводорослей и цианобактерий // Биохимия. 2021. — Т. 86. — В. 7. — С 1055 – 1066.
2. Стадничук И.Н., Новикова Т.М., Минюк Г.С., Бойченко В.А., Болычевцева Ю.В., Гусев Е.С., Лукашев Е.П. Функциональная связь фикоэритрина с фотосистемой II у криптофитовой водоросли Rhodomonas salina // Биохимия. – 2020. –Т. 85, в. 6, с. 796 – 806.
3. Зотов В.С., Болычевцева Ю.В., Хапчаева С.А., Терехова И.В., Шубин В.В., Юрина Н.П., Кульчин Ю.Н. Влияние спектрального состава освещения на выход биомассы, флуоресценцию хлорофилла фотосистемы II // Прикладная биохимия и микробиология. –2020. – Т.56. — № 3. с. 336-343.
4. Pishchalnikov R.Y., Shubin V.V., Razjivin A.R. The role of vibronic modes in formation of red antenna states of cyanobacterial PSI // Photosynthesis Research. – 2020. – Vol.146 — P.75-86. DOI: 10.1007/s11120-020-00779-y.
5. . Pishchalnikov R., Shubin V., Razjivin A. Single Molecule Fluorescence Spectroscopy of PSI Trimers from Arthrospira platensis: A Computational Approach // Molecules. — 2019. —  Vol. 24. — P. 822.
6. Болычевцева Ю.В., Терехова И.В., В. В. Шубин В.В., Юрина Н.П. Термостабильность мономеров и тримеров фотосистемы I цианобактерии Arthrospira platensis. Прикладная биохимия и микробиология. 2019, том 55, № 3, с. 286–292.
7. Yurina N., Sharapova L., Characrerization of high light inducible (Hli) proteins of chlorophyll-protein complexes of cyanobacteria. Ecologia Balkanica. 2020. Special Edition 3 pp. 139-146.
8. Yurina N., Sharapova L. Identification of high light-induced Hli protein in pigment-protein complexes of thylakoid membranes of cyanobacteria Arthrospira platensis. // FEBS Open Bio. 2021. Vol 11, No S1. P.384-385. doi:10.1002/2211-5463.13205.
9. Шарапова Л.С., Юрина Н.П., Идентификация стрессового белка Hli в пигмент-белковых комплексах Arthrospira platensis. Прикладная биохимия и микробиология. 2021. Т.57, №6, С.549-555.
10. Rogov A.G., Goleva T.N., Sukhanova E.I., Epremyan K.K., Trendeleva T.A., Ovchenkova A.P., Aliverdieva D.A., Zvyagilskaya R.A. Mitochondrial Dysfunctions May Be One of the Major Causative Factors Underlying Detrimental Effects of BenzalkoniumChloride // Oxidative Medicine and Cellular Longevity – 2020. – Vol 2020, Article ID 8956504, 14 pages https://doi.org/10.1155/2020/8956504.
11. Goleva Т.N., Lyamzaev K.G., Rogov A.G. et al. Mitochondria-targeted 1,4-naphthoquinone (SkQN) is a powerful prooxidant and cytotoxic agent // BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-BIOENERGETICS. –2020. – Vol. 1861(8). 148210. DOI: /10.1016/j.bbabio.2020.148210.
12. Rogov A.G., Goleva T.N., Epremyan K.K., Kireev I.I., Zvyagilskaya R.A. Propagation of Mitochondria-Derived Reactive Oxygen Species within the Dipodascus magnusii Cells // Antioxidants (Basel). — 2021. — №1. – Р.120. doi: 10.3390/antiox10010120.
13. Dmitry Mamaev, Renata Zvyagilskaya. Yarrowia lipolytica: a multitalented yeast species of ecological significance // FEMS Yeast Res. – 2021. — № 2. – Р. foab008. doi: 10.1093/femsyr/foab008.

1. Тестирование влияния физиологически-активных соединений на энергетические параметры выделенных митохондриальных препаратов и клеток