Ключевые слова
эпигенетика, метилирование ДНК, метил-ДНК-связывающие белки, перепрограммирование соматических клеток, генетический нокаут, редактирование генома, гипоксия и гиперосмос, регуляция транскрипции, посттрансляционные модификации, воспаление и опухолеобразование

Направления исследований

• Исследование реализации эпигенетической информации при повреждении ДНК
• Редактирование генома клеток млекопитающих с помощью CRISPR/Cas9 системы
• Исследование влияния повышенной концентрации NaCl на процесс соматического перепрограммирования
• Изучение эпигенетических изменений в процессе перепрограммирования мышиных эмбриональных фибробластов лишенных белка Каизо
• Исследование устойчивости к воспалительным процессам и образованию опухолей у Kaiso-/y мышей
• Изучение роли убиквитин лигазы VHL и индуцированного гипоксией HIF1a в норме и патологии клеток почек человека
• Оценка эпигенетической реакции генома на изменения уровня HIF1a в норме и патологии
• Влияние эпигенетических механизмов на иммунный ответ
• Биоинформатика и вычислительная биология
• Палеогеномика

Основные методы исследований
В нашей лаборатории используется современный метод редактирования генома клеток млекопитающих на основе CRISPR/Cas9 системы.

Методы фундаментальных исследований:
1. Молекулярно-биологические методы:

• стандартные методы молекулярного клонирования (получение векторов, генетических конструкций);
• работа с ДНК (плазмидной и геномной, ПЦР, гибридизация и т.д.), РНК (ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени, и т.д.), белками (иммуноблотинг, иммунопреципитация, выделение и тд.);
• метод бисульфитной конверсии;
• метод анализа образования комплекса ДНК-белок (EMSA assay);
• метод иммунопреципитации хроматина (ChIP);

2. Работа с эукариотическими клеточными линиями млекопитающих:

• с иммортализованными культурами клеток млекопитающих;
• с первичными культурами клеток млекопитающих;
• со стволовыми клетками и получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из соматических;
• методы трансфекции, индукции, иммунофлуорисценции
•  редактирование генома клеток млекопитающих
• оценка пролиферации, апоптоза и клеточного цикла

3. Работа с генно-модифицированными линиями мышей

• получение моделей мышей с воспалением, различными заболеваниями, опухолеобразованием и т.д., путем индукции различными биологическими или химическими факторами
• физиологические, биохимические, цитологические исследования, иммуногистохимия.

4. Методы необходимые для полногеномного анализа:

• поучения геномных библиотек для полногеномного анализа метилированных CpG (метод RRBS);
• получение РНК-библиотек для полногеномого анализа экспрессии генов;
• полногеномное картирование участков связывания белков и транскрипционных факторов

5. Биоинформатические методы анализа:

• разработка и создание баз данных
• обработка и анализ данных, полученных в ходе полногеномного секвенирования (ChIPseq, RNAseq, RRBS, de novo сборка)
• регуляторная геномика
• методы многомерного анализа данных и машинное обучение

Краткая история лаборатории
Лаборатория геномики и эпигеномики позвоночных была организована в Центре «Биоинженерия» РАН в 2005 году. Заведующий лаборатории начиная с 2005 года Прохорчук Егор Борисович.

ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

Изучение метил-ДНК-связывающих белков
Нами был охарактеризован метил-ДНК-связывающий белок Каизо (Prokhortchouk et al, GenesDev 2001). Каизо, с одной стороны, связывается с катенином р120, а с другой — способен подавлять транскрипционную активность метилированных генов. Каизо имеет доменную структуру и состоит из N-концевого BTB/POZ домена и C-концевых «цинковых пальцев» типа C2H2. «Цинковые пальцы» специфично связывают 5-метилцитозин содержащую ДНК, а также CTGCNA (Каизо связывающий сайт). В 2009 году в клетках Пуркинье Kriaucionis S et.al. (Science 2009) нашли новое азотистое основание – 5-гидроксиметилцитозин (5hmC) – продукт окисления 5-метилцитозина (5mC) белками ТЕТ. Гидроксиметилирование ДНК в генных участках коррелирует с экспрессией этих генов. Мы показали, что присутствие 5hmC в составе Каизо связывающих сайтов приводит к потере сродства белка Каизо с ДНК, что может способствовать изменению спектров белков-корепрессоров, привлекаемых к промоторам. При этом Каизо сохраняет способность связываться с полугидроксиметилированной/метилированной ДНК (hmC/mC) (Женило С.В. и др., Мол. Биол., 2013). Возможно, белок Каизо принимает участие в регуляции уровня 5hmC.

Совместно с Эдинбургским Университетом мы получили линию мышей с генетическим нокаутом гена Каизо (КО). Полученные животные развивались нормально и не имели выраженных патологий. Однако, при переведении КО животных на генетический фон с высоким процентом спонтанных опухолей кишечника происходило увеличение срока жизни животных, уменьшался средний размер полипов в кишечнике. Таким образом, нами установлено, что в отсутствии белка Каизо происходит замедление роста опухолей кишечника в APC(Min) моделях (Prokhortchouk A. et al, Mol Cel Biol. 2006). Напротив, при выключении гена Каизо в зиготах лягушки происходит апоптотическая смерть клеток эмбрионов на стадии нейрулы. В отличие от мыши, ген Каизо является необходимым для жизнедеятельности земноводных. Эти данные были подтверждены и на рыбах Danio Rerio.

В 2006 году были охарактеризованы белки ZBTB4 и ZBTB38, которые по своей аминокислотной последовательности и расположению консервативных доменов являются гомологичными белку Каизо. Показано, что эти два белка являются метил-ДНК зависимыми транскрипционными репрессорами (Filion G., Zhenilo S., et al, Mol Cel Biol. 2006).

Участие в Российских и Международных научных проектах
Наша лаборатория активно участвует в российских и международных крупных научных проектах. Одним из научных достижений является результат участия в Российском проекте по моделированию инфаркта миокарда (ИМ) на мышах. Впервые в России был разработан минимально инвазивный метод моделирования инфаркта миокарда у мышей с помощью лигирования коронарной артерии сердца (Ovsepyan AA, Panchenkov DN, Prokhortchouk EB, Telegin GB, Zhigalova NA, et al, Acta Naturae. 2011). Данная модель может быть применима к геномодифицированным линиям мышей, для поиска эффективных способов лечения ИМ заместительной клеточной терапией.

С 2009 по 2014 год Центр «Биоинженерия» РАН сотрудничает с европейским сообществом в рамках европейского проекта CAGEKID по теме «Изучения генома рака почки». Нами было проведено полногеномное ассоциативное исследование, направленное на поиск однонуклеотидных полиморфизмов, связанных с возникновением рака почки. Были найдены два локуса в участках 2р21 и 11q13.3, для которых показана статистически достоверная корреляция с возникновением рака почки (9). Одно из направлений нашего проекта заключается в изучении эпигенетических изменений ДНК в раке почке. Полученные данные могут внести большой вклад в раннюю диагностику рака почки.

С 2011 г. Медведева Ю.А. сотрудничает с международным консорциумом FANTOM5, в рамках этого сотрудничества был получен атлас сайтов инициации транскрипции в геноме человека в более чем 1000 различных образцов (A promoter-level mammalian expression atlas. 2014). В рамках этой коллаборации были также выявлены позиции в геноме человека, метлиирование которых надежно отражает экспрессию соответствующих генов (Medvedeva et al., Effects of cytosine methylation on transcription factor binding sites., 2014).

Изучение влияния осмотического стресса на эпигенетические механизмы в процессе перепрограммирование клеток млекопитающих
В нашей лаборатории мы используем два способа получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из клеток мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ). В первом случае мы инфицируем клетки МЭФ лентевирусами, несущими факторы Яманаки (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc). Второй способ заключается в использовании генетической модели — линия мышей с индуцибельной доксициклином кассетой, содержащая факторы Яманаки. После «запуска» перепрограммирования, на 3 дней культивирования мы добавляли 100мМ NaCl. В результате осмотического стресса из МЭФ образовалось больше совершенных колоний ИПСК чем из МЭФ содержащихся в физиологических условиях. В настоящее время с помощью метода RRBS мы изучаем динамику метилирования по всему геному в процессе перепрограммирования соматических клеток.

Биоинформатика
Медведева Ю.А. участвовала в разработке базы данных моделей сайтов связывания транскрипционных факторов HOCOMOCO (Kulakovskiy IV, Medvedeva YA, et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res., 2013), а также базы эпигенетических регуляторов (Medvedeva Y, et al. EpiFactors: a comprehensive database of human epigenetic factors and complexes. Database, 2015). Данная база содержит модели высокого качества для сайтов связывания более 400 белков-факторов инициации транскрипции. Медведева Ю.А. также принимала участие в разработке программы GenometriCorr (Favorov A, Mularoni L, et al. Exploring massive, genome scale datasets with the GenometriCorr package. PLoS Comput Biol., 2012), позволяющая оценить статистическую значимость ко-локализации объектов в геноме, что позволяет выдвигать предположения о функциональной связи.

СОСТАВ ЛАБОРАТОРИИ

УНИКАЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

1. Chung-Chau Hon, Jordan A. Ramilowski, Jayson Harshbarger, Nicolas Bertin, Owen J. L. Rackham, Julian Gough, Elena Denisenko, Sebastian Schmeier, Thomas M. Poulsen,Jessica Severin, Marina Lizio, Hideya Kawaji, Takeya Kasukawa, Masayoshi Itoh, A. Maxwell Burroughs, Shohei Noma, Sarah Djebali, Tanvir Alam, Yulia A. Medvedeva, Alison C. Testa, Leonard Lipovich, Chi-Wai Yip, Imad Abugessaisa, Mickaël Mendez, Akira Hasegawa, Dave Tang, Timo Lassmann, Peter Heutink, Magda Babina, Christine A. Wells,Soichi Kojima, Yukio Nakamura, Harukazu Suzuki, Carsten O. Daub, Michiel J. L. de Hoon,Erik Arner, Yoshihide Hayashizaki, Piero Carninci & Alistair R. R. Forrest. An atlas of human long non-coding RNAs with accurate 5′ ends. — Nature 543, 199–204, 2017, doi:10.1038/nature21374
2. Prokhortchouk A.V., Hendrich B., Jorgenson H., Ruzov A.S., Wilm M., Georgiev G.P., Bird A., Prokhortchouk E.B. The P120 catenin partner KAISO is methylation dependent transcriptional repressor. — Genes Dev., 2001,  Jul 1;15(13):1613-8.
3. Ruzov A., Dunican D., Prokhortchouk A., Pennings S., Stancheva I., Prokhortchouk E., Meehan R. Kaiso is a genome wide repressor of transcription that is essential for amphibian development. — Development, 2004, v.131:6185-94
4. Prokhortchouk A., Sansom O., Selfridge J., Caballero I., Salozhin S., Aithozhina D., Cerchietti L., Meng F-G., Augenlicht L., Mariadason J., Hendrich B., Melnick A., Prokhortchouk E., Clarke A., Adrian Bird. Kaiso-Deficient Mice Show Resistance to Intestinal Cancer. — Mol Cel Biol, 2006, v.26б:199-208
5. Filion G., Zhenilo S., Salozhin S., Yamada D., Prokhortchouk E., Defossez P-A. A Family of Human Zinc Finger Proteins That Bind Methylated DNA and Repress Transcription. — Mol Cel Biol, 2006, v. 26б: 169-81
6. Barr H., Hermann A., Berger J., Tsai H.H., Adie K., Prokhortchouk A., Hendrich B., Bird A. Mbd2 contributes to DNA methylation-directed repression of the Xist gene. — Mol Cel Biol, 2007, 3750-7
7. Lopes EC, Valls E, Figueroa ME, Mazur A, Meng FG, Chiosis G, Laird PW, Schreiber-Agus N, Greally JM, Prokhortchouk E, Melnick A. Kaiso contributes to DNA methylation-dependent silencing of tumor suppressor genes in colon cancer cell lines. Cancer Res, 2008, v. 68- p. 7258-7263
8. Ruzov A, Savitskaya E, Hackett JA, Reddington JP, Prokhortchouk A, Madej MJ, Chekanov N, Li M, Dunican DS, Prokhortchouk E, Pennings S, Meehan RR. The non-methylated DNA-binding function of Kaiso is not required in early Xenopus laevis development. — Development, 2009, v. 136- p. 729-738
9. Ruzov A, Hackett JA, Prokhortchouk A, Reddington JP, Madej MJ, Dunican DS, Prokhortchouk E, Pennings S, Meehan RR. The interaction of xKaiso with xTcf3: a revised model for integration of epigenetic and Wnt signalling pathways. — Development, 2009, v. 136 p. 723-727
10. Purdue MP, Johansson M, Zelenika D, Toro JR, Scelo G, Moore LE, Prokhortchouk E et al. Genome-wide association study of renal cell carcinoma identifies two susceptibility loci on 2p21 and 11q13.3. — Nat Genet, 2011, 43: 60-65.