На сегодняшний день микроорганизмы и их ферменты играют значимую роль в развитии биотехнологии и используются во многих сферах деятельности человека. Необычайное разнообразие прокариот, бóльшая часть которых пока остается некультивируемыми, представляет для ученых по всему миру настоящий «клондайк» для поиска новых белков и изучения взаимодействий микроорганизмов в естественной среде обитания. Ученые из Германии разработали новый мультиомный метод, позволяющий напрямую находить ферменты на основании их функций в микробных сообществах непосредственно в их родной среде обитания. Метод позволяет заполнить пробел между метагеномикой, предсказанием функции белков и их активностью in vivo. Эффективность новой технологии была экспериментально доказана в «полевых» условиях, в горячих источниках Камчатки, совместно с учеными ФИЦ Биотехнологии РАН (Москва). Статья с описанием нового метода и результатов его апробации опубликована в Environmental Microbiome.
Роль микробных сообществ в функционировании экосистем обеспечивается уникальным набором ферментов, предоставляющих для исследователей огромный, и все еще во многом скрытый потенциал. Изучение особенностей и возможностей белков не только позволяет лучше понять, как микроорганизмы функционируют в естественной среде обитания (фундаментальные экологические исследования), но и превращает микробные сообщества, особенно из экстремальных местообитаний, в ценный ресурс для поиска новых ферментов с потенциальным применением в биотехнологии, а впоследствии –во многих отраслях народного хозяйства.
Для поиска нужных ферментов применяются различные способы, направленные на идентификацию микроорганизмов по спектру белков, так называемые методы белкового профилирования. Но даже наиболее современные методы, опирающиеся на метагеномные подходы в сочетании с биоинформатическим анализом, зачастую не могут дать точное предсказание функций протеомов микроорганизмов и расшифровку активности их ферментов in vivo.
Одним из перспективных методов на сегодняшний день является профилирование белков на основании их активности (ABPP, activity-based protein profiling). Эта протеомная технология, направленная на определение функции белков и изучение активности ферментов в сложных биологических системах, использует специальные зонды, нацеленные на связывание с различными ферментами или целыми классами ферментов. Зонд обычно состоит из «боеголовки», которая связывается с активным центром фермента, метки и пептидного участка. ABPP позволяет не только визуализировать меченые ферменты с помощью флуоресцентных групп, но и идентифицировать ферменты-мишени с помощью масс-спектрометрии.
Метод ABPP успешно применяется в биомедицине для обнаружения биомаркеров или лекарственных препаратов, а также в микробиологии для изучения патогенов и взаимодействий хозяин-патоген. Недавно метод ABPP был использован для поиска биокатализаторов для промышленного применения – для определения ферментов, разлагающих лигноцеллюлозу.
На основе этого перспективного протеомного анализа ученые из Германии разработали новый мультиомный подход – метод «экологического» профилирования белков на основе их активности (environmental activity-based protein profiling, eABPP). Он основан на мечении активно работающих в сообществе ферментов в сочетании с секвенированием метагенома. При такой технологии аннотация метагенома подкрепляется выявленными активностями белков.
Важно, что новый метод позволяет изучать (профилировать) белковые спектры микроорганизмов, в том числе неизученных и неизвестных пока еще таксонов, в их родной среде обитания. Это стало возможным благодаря специально разработанной процедуре подготовки проб и анализа данных, которая позволяет обнаруживать отдельные активные ферменты в сложном экологическом метапротеоме.
Для экспериментального подтверждения эффективности нового метода ученые применили его в «полевых» условиях. Для испытаний были выбраны экстремальные сразу по нескольким характеристикам природные места обитания – два горячих слабокислых источника, расположенных в кальдере вулкана Узон на Камчатке. В исследовании приняли участие сотрудники лаборатории метаболизма экстремофильных прокариот ФИЦ Биотехнологии РАН. Работа проводилась в рамках совместного гранта Российского научного фонда и Немецкого научно-исследовательского сообщества.
 |
 |
В качестве успешного применения нового метода непосредственно в местах отбора проб российскими и немецкими учеными были поставлены эксперименты, которые выявили активно работающие термостабильные сериновые гидролазы различного спектра действия. Результаты исследования свидетельствуют о высоком разнообразии микробного состава отобранных сообществ и о наличии в них разнообразных ферментов с серин-гидролазной активностью. Обнаруженные группы прокариот в значительной степени состоят из неизученных микроорганизмов, функциональный потенциал которых еще предстоит раскрыть.
Экспериментальный анализ, проведенный в горячих источниках Камчатки, продемонстрировал эффективность нового метода eABPP, а последующие биохимические исследования подтвердили, что данный подход может быть успешно использован для определения активности ферментов in vivo.
 |
 |
Новый мультиомный подход позволит вывести исследования, направленные на поиск ценных ферментов, на новый уровень, а также внесет вклад в экологические исследования взаимодействий внутри микробных сообществ в естественных местах обитания.