Сотрудники ФИЦ Биотехнологии РАН вместе с коллегами из Института иммунологии ФМБА России предложили новый способ получения нетоксичного производного дифтерийного токсина CRM197. Этот белок широко используется в получении вакцин как в качестве антигена, на который реагирует иммунная система, так и белка-носителя для антигенных полисахаридов бактерий. Результаты исследования опубликованы в журнале BioTech и уже применяются в разработке новых вакцин.
Суть работы вакцин заключается в том, чтобы иммунная система отреагировала на определенный антиген (потенциально опасное вещество, обычно один из белков патогена), который содержится в препарате. Так организм может познакомиться с возбудителем безопасно, не заболевая, и при последующей встрече оперативно его обезвредить.
Однако препарат только с целевым антигеном может быть недостаточно эффективным, например, слишком быстро разрушаться в крови и оттого плохо «запоминаться». Усилить его можно при помощи особых добавок — адъювантов. Они служат либо носителями антигена, обеспечивая его длительное циркулирование в организме и даже доставку в определенные иммунные клетки, либо дополнительными раздражителями, которые воспринимается врожденными механизмами защиты и сразу вызывают сильную реакцию.
Ученые ФИЦ Биотехнологии РАН вместе с коллегами из Института иммунологии ФМБА России придумали, как улучшить производство одного из наиболее популярных адъювантов — белка CRM197. Традиционно его получают из мутантной патогенной дифтерийной коринебактерии, но ее культуры растут достаточно медленно и выход продукта мал. Авторы создали новый штамм кишечной палочки, который способен синтезировать целевой белок.
Для удобства они удалили из исходной последовательности природный сигнальный фрагмент и поставили метку из трех нуклеотидов, которая направляет CRM197 в цитоплазму, откуда его несложно извлечь. Также биотехнологи сделали небольшую замену во втором триплете последовательности (кодирует вторую аминокислоту в составе белка), что позволило в 4-5 раз увеличить накопление продукта в клетках. Такой эффект авторы объяснили изменением вторичной структуры матрицы РНК, на которой синтезируется белок. До модификации в этом месте находилась шпилька — петля из-за взаимодействия триплетов, — которая затрудняет посадку на них транспортной РНК с аминокислотами, а значит, и синтез белка происходил не столь эффективно.
Кроме того, исследователи предложили подход к выращиванию культуры и очистке белка. Во-первых, они снизили температуру культивирования на этапе активного синтеза до комнатной, тогда как оптимальная для кишечной палочки — 37°C. Это уменьшило интенсивность наработки белка, но и дало время для его правильного сворачивания (только в таком случае он будет нормально взаимодействовать с иммунными клетками), а также обеспечило оптимальные условия для работы систем бактерии, которые помогают исправить ошибки в укладке. Во-вторых, после разрушения клеток и ультрафильтрации авторы очищали белок в ходе трех этапов хроматографии, пропуская раствор через колонки с разным сорбентом и с разным составом и характеристиками растворителя. Исходно, еще на этапе дизайна ДНК, они удалили последовательности, которые потом все равно пришлось бы удалить, и не добавили новые «хвосты» (их часто вводят, чтобы избирательно выловить белки из раствора, однако от них тоже нужно избавиться), а потому процесс оказался проще. В результате удалось добиться выхода продукта в 150–270 миллиграмм на литр конечной клеточной культуры. Ранее коллегам удавалось достичь в такой системе и с CRM197 не более 150 миллиграмм на литр.
«Созданный штамм-продуцент растворимого CRM197 и разработанный метод очистки могут использоваться для экономически обоснованного производства этого белка и последующего синтеза конъюгированных вакцин против гемофильных, пневмококковых и менингококковых инфекций. Наши результаты уже используются компанией, создающей вакцины для людей, и мы участвуем в разработке новых препаратов», — рассказывает Иван Воробьев, доктор биологических наук, заведующий лабораторией биоинженерии клеток млекопитающих ФИЦ Биотехнологии РАН.