Развитие молекулярной биологии и биотехнологий позволило создать множество биосенсоров и тестов для диагностики — от быстрых анализов на COVID-19 до экспресс-тестов на патогены, поражающие сельскохозяйственные растения. Ученые из ФИЦ Биотехнологии РАН создали платформу DIRECT2, которая может дать начало экспресс-тестам нового поколения на основе системы CRISPR-Cas12, и продемонстрировали ее работу на образцах с ДНК Dickeya solani — бактерии, которая поражает сельскохозяйственные растения. Принципы работы новой платформы и ее сравнение с другими методами биотехнологи изложили в журнале Biosensors and Bioelectronics.
Системы из генного участка CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), накопителя информации о ранее встреченных вирусах, и белка-нуклеазы семейства Cas (CRISPR associated protein) обеспечивают иммунитет бактерий, защищая от повторного заражения теми же вирусами. Программируемость этих систем и высокая специфичность распознавания генетической мишени позволяют использовать их в разработках по редактированию геномов. А в последние годы CRISPR-Cas системы начали применять и в биосенсорах, с высокой чувствительностью распознающих определенные последовательности ДНК или РНК. Российские ученые создали новую платформу, сочетающую CRISPR-Cas технологию, универсальный ДНК-белковый зонд и мембранный экспресс-тест, которая решает задачи бесприборной диагностики лучше существующих аналогов.
«Диагностические системы на основе CRISPR-Cas12 имеют огромный потенциал стать инструментом нового поколения; они крайне чувствительны и специфичны. Мы предложили использовать закрепленный на носителе зонд, состоящий из одноцепочечного участка ДНК и связанного с ним антитела. Фермент Cas12 узнает последовательность ДНК-мишени, расщепляет ДНК в зонде и высвобождает антитело. Для выявления этого антитела используется тест-полоска, окрашивание определенной зоны которой свидетельствует о наличии целевой ДНК в пробе. Специфичность распознавания с помощью CRISPR-Cas12 и визуально распознаваемый сигнал, напрямую зависящий от количества ДНК-мишени, значительно снижают вероятность ошибок тестирования» — рассказал один из авторов работы Борис Дзантиев, профессор, доктор химических наук, заведующий лабораторией иммунобиохимии ФИЦ Биотехнологии РАН.
Белок Cas12 в комплексе с гидовой РНК распознает ДНК-мишень в пробе, сверяя ее последовательность с гидовой РНК — аналогично тому, как в бактериальной клетке проводится сверка с данными о ранее встреченных вирусах. Затем комплекс CRISPR-Cas12 разрезает ДНК-мишень и приобретает способность многократно расщеплять любые одноцепочечные ДНК. Используя одноцепочечные ДНК с присоединенной меткой (ДНК-зонд), можно регистрировать высвобождение этой метки, например, с помощью мембранного теста. В результате весь процесс тестирования протекает без сложного оборудования и с минимальными действиями оператора, что позволяет его проводить во внелабораторных условиях. Однако в ранее предлагавшихся разработках нерасщепленный ДНК-зонд также связывался тестом, что могло искажать результаты анализа.
Для преодоления этой трудности авторы работы создали биосенсор, в котором на носителе закреплен зонд, состоящий из ДНК-части (одноцепочечной ДНК с флуоресцеиновой меткой) и белковой части (мышиные антитела против флуоресцеиновой метки). Активированный ДНК-мишенью белок Cas12 разрезает зонд. Высвобожденная конструкция (репортер) детектируется иммунохроматографическими тест-полосками благодаря специфическому связыванию антитела с анти-мышиными антителами, расположенными на мембране и на поверхности золотых наночастиц. Платформа получила название DIRECT2 (сокращенно от DNA-Immunoglobulin Reporter Endonuclease Cleavage Test).
«Предложенный нами формат анализа позволяет напрямую связывать на мембране только расщепленный ДНК-зонд. Интенсивность окрашивания определяется концентрацией в пробе искомого патогена, в состав которого входит ДНК-мишень. Модульная структура платформы DIRECT2 позволяет развивать ее, адаптируя к различным задачам диагностики и улучшая характеристики анализа», — поясняет первый автор статьи Александр Иванов, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории иммунобиохимии ФИЦ Биотехнологии РАН.