Ключевые слова
Mycobacterium tuberculosis, Mycolicibacterium smegmatis, “некультивируемые” бактерии, биохимия и физиология покоя неспорообразующих бактерий, микобактерии, коринебактерии, латентный туберкулез, реактивация покоящихся форм возбудителя туберкулеза, антибактериальные вещества, транскриптомика, метаболомика, протеомика, антимикробная фотодинамическая терапия, порфирины

Направления исследований

• Изучение биохимических процессов адаптации бактерий к стрессовым условиям
• Изучение биохимии и физиологии состояния покоя у бактерий (микобактерии, коринебактерии)
• Создание моделей латентного туберкулеза in vitro
• Изучение механизмов длительной персистенции и реактивации микобактерий
• Транскриптомный, метаболомный и протеомный анализ покоящихся форм микобактерий
• Поиск новых антибактериальных соединений активных против покоящихся форм микобактерий
• Разработка новых подходов к диагностике туберкулеза
• Антибактериальная фотодинамическая терапия и способы стимуляции продукции эндогенных фотосенсибилизаторов в микобактериях
• Исследование новых лекарств-кандидатов в моделях инфекции in vitro и in vivo (совместно с ЦНИИТ РАН)
• Изучение структуры и свойств ингибирующих компонентов, секретируемых бактериями – антагонистами микобактерий

Основные методы исследований
В рамках проводимых в лаборатории исследований используются следующие методы:

• культивирование бактерий в специальных условиях для получения покоящихся форм
• характеристика бактериальных форм методами микробиологии, биохимии, флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии
• создание молекулярных генно-инженерных конструкций для экспрессии целевых белков и получения мутантных клеток с гиперэкспрессией целевых белков
• получение нокаутных штаммов микобактерий (в том числе М.tuberculosis) с помощью аллельного обмена
• проведение транскриптомных (next generation), метаболомных и протеомных исследований
• скринирование новых антибактериальных (в том числе противотуберкулезных) соединений на моделях активных и покоящихся клеток

Краткая история лаборатории
Лаборатория была создана в 1996 году на базе лаборатории Функциональной биохимии мембран, руководимой проф. Островским Д.Н. – известным российским биохимиком, специалистом в области мембран бактерий. В свою очередь, лаборатория, руководимая Д.Н. Островским была создана в 1981 году в результате реорганизации лаборатории Эволюционной биохимии, руководимой академиком А.И. Опариным — выдающимся российским ученым, автором теории происхождения жизни. До 2022 года лабораторией руководил проф. Капрельянц А.С. — известный биохимик в области изучения молекулярных механизмов адаптации неспорообразующих бактерий к стрессовым условиям, автор концепции топодинамической регуляции метаболических процессов в живой клетке. Под его руководством и при непосредственном участии в 1998 году был открыт белок Rpf, являющийся фактором, стимулирующим реактивацию покоящихся бактерий.

ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

Лаборатория занимается исследованием молекулярных механизмов адаптации неспорообразующих бактерий к стрессовым условиям внешней среды. Наиболее интенсивные исследования проводятся в области изучения  механизмов образования и реактивации покоящихся и «некультивируемых» форм микобактерий и разработку новых методов их иррадикации и диагностики.

Эти фундаментальные исследования  имеют целью раскрытие механизмов латентного туберкулеза- заболевания, которому подвержена 1\4 населения Земли. В этой связи коллектив лаборатории создает оригинальные модели in vitro покоящихся клеток возбудителя туберкулеза, на которых проводятся исследования особенностей биохимии и физиологии у таких форм и при их реактивации в активные, размножающееся бактерии. В частности, особенное внимание уделяется изучению факторов инициации реактивации и стимуляции размножения покоящихся клеток. Разработанные модели используются также для тестирование новых антибактериальных (антитуберкулезных) соединений,  способных убивать не только активные, но и покоящиеся формы.

Лаборатория принимает участие в многочисленных исследовательских проектах совместно с другими отечественными лабораториями и международными партнерами. Партнерами Лаборатории являются: ИБХ РАН. Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАН, Национальный исследовательский медицинский центр фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний Минздрава РФ.

В лаборатории проводились научные исследования в рамках международных проектов Еврокомиссии FP6  и FP7.

В лаборатории получены гранты по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», 10 грантов РФФИ, 4 гранта РНФ и др. Коллектив опубликовал 42 статьи за 2015-2022гг.

В лаборатории постоянно ведется работа с молодежью и проводится работа по подготовке молодых специалистов. С 2000 года по тематике исследований были защищены  9 кандидатских диссертаций и 2 докторских.

За 2010-2022 годы получены следующие важные результаты:

1. В области механизмов образования и характеристики покоящихся клеток бактерий

• разработана уникальная модель in vitro образования длительно выживающих покоящихся микобактерий (в том числе Mycobacterium tuberculosis) и Corynebacterium jeikeium на основе их адаптации к условиям плавного понижения рН внешней среды c последующим хранением культур в микроаэрофильных условиях, имитирующая условия, возникающие в макрофагах при захвате микобактерий. Покоящиеся микобактерии обладают существенно сниженной активностью метаболизма, овоидной формой клеток, утолщенной клеточной стенкой, устойчивостью к воздействию антибиотиков/стрессорных факторов, а также способностью сохраняться без размножения в жидких средах длительное время без существенной потери жизнеспособности
• выявлены три стадии глубины покоя микобактерий, определяемые по скорости реактивации и отражающие уровень снижения метаболической активности, развитие «некультивируемости» и способности покоящихся микобактерий к реактивации
• Совместно с ЦНИИТ РАН установлено, что мыши, инфицированные полученными in vitro в условиях рН-индукции покоящимися «некультивируемыми» формами M. tuberculosis, проявляли симптомы, характерные для хронического/латентного туберкулеза. Через 18 месяцев после заражения у мышей развивалась активная форма ТБ. Разработанная модель носительства туберкулеза in vivo у животных является пока единственной для изучения латентной формы туберкулеза
• Выявлено, что покоящиеся клетки микобактерий аналогично экзоспорам стрептомицетов и спорам аскомицетовых дрожжей способны накапливать большие количества трегалозы в процессе перехода в состояние покоя и расходовать ее при реактивации
• Впервые охарактеризован протеомный профиль микобактерий, находящихся в состоянии длительного покоя и «некультивируемости». Показано, что в период длительного выживания в неблагоприятных для роста условиях в покоящихся микобактериях содержится значительное разнообразие сохраненных белков, значительная часть (45 %) которых не выявляется в протеоме активно размножающихся микобактерий. Обнаружены некоторые ферменты центрального метаболизма (гликолиз, цикл Кребса), сохраняющие потенциальную активность, а также большое число белков, участвующих в защите бактериальной клетки от действия стрессорных факторов
• Метаболический анализ показал, что даже после длительного хранения и замедления метаболизма в клетках микобактерий сохраняются значительные концентрации депонированных ключевых метаболитов
• выявлен белок (гистоноподобный белок hlp), участвующий в образовании  покоящихся форм микобактерий и обеспечивающий их стабильность
• с помощью протеомного анализа выявлены белки с максимальной представленностью в покоящихся клетках  M.tuberculosis
• получены доказательства индукции покоящихся форм микобактерий под действием белка токсина модуля «токсин-антитоксин»
• установлено, что покоящиеся формы микобактерий Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis синтезируют красный пигмент, относящийся к порфиринам  c внутриклеточной и внеклеточной локализацией. Возможно этот пигмент является одним из факторов стабилизации покоящихся клеток
• с помощью транскриптомного анализа обнаружено, что покоящиеся клетки M.tuberculosis сохраняют в достаточно большом количестве транскриптов, которые, возможно,  являются запасенными для использования в начальной стадии реактивации покоящихся клеток. В этих же клетках обнаружено наличие некодирующих РНК, включая антисмысловые транскрипты и малые межгенные РНК. Поскольку эти РНК практически не представлены в транскриптомe активных клеток, можно полагать, что они выполняют пока не известные специфические функции в условиях латентного туберкулеза

2. В области изучения механизмов реактивации покоящихся клеток микобактерий

• установлено, что фосфолипиды и свободные ненасыщенные жирные кислоты (СНЖК) в низких концентрациях могут индуцировать реактивацию покоящихся микобактерий; выявлена роль аденилатциклаз MSMEG_4279 и Rv2212, а также транскрипционного фактора Rv3676, зависимого от цАМФ, как в процессе реактивации микобактерий в присутствии СНЖК, так и стимулировании роста микобактерий. Установлено, что СНЖК активируют цАМФ–зависимый синтез белка RpfA. В результате ферментативной активности белков Rpf и RipA образуются фрагменты пептидогликана (муропептиды), стимулирующие реактивацию покоящихся микобактерий. Получены доказательства участия аденилатциклазы в реактивации покоящихся клеток микобактерий под действием свободных жирных кислот
• Продемонстрировано, что нитрофенилтиоцианаты ингибируют энзиматическую активность белков Rpf и способны подавлять реактивацию ПМ из «некультивируемого» состояния in vitro и in vivo
• обнаружено, что фрагменты бактериальной клеточной стенки и муропептиды являются сигнальными молекулами для стимуляции реактивации покоящихся клеток микобактерий
• сформулирована гипотеза о трехстадийном процессе реактивации покоящихся клеток микобактерий. Процесс реактивации покоящихся микобактерий включает несколько стадий: истинная лаг-фаза, включающая гидролиз трегалозы; метаболическая реактивация, включающая начало биосинтетических процессов и начальная стадия деления клеток.

3. В области поиска и изучения новых антибактериальных средств

• найдены новые производные ортотиоцианатнитроарилов, проявляющие ингибирующую активность по отношению к белкам Rpf и одновременно подавляющие реактивацию покоящихся микобактерий
• выявлено, что синтезированные ингибиторы белков Rpf супрессируют реактивацию латентного туберкулеза на мышах
• обнаружен новый класс химических соединений 2-тиопиридинов, проявляющих значительную активность в отношении покоящихся клеток M. tuberculosis in vitro
• обнаружено, что новые полимеры- протонированные полидиалиламины (ПДАА) обладают высокой стерилизующей активностью против микобактерий, в частности против M.tuberculosis
• Установлено, что покоящиеся микобактерии, содержащие эндогенные порфирины, могут быть фотоинактивированы с помощью света. Разработаны подходы, позволяющие увеличивать количество эндогенных фотосенсибилизаторов как в покоящихся, так и в вегетативных формах микобактерий и коринебактерий, что повышает их фоточувствительность. Было продемонстрировано успешное применение антибактериальной фотодинамической терапии для инактивации покоящихся клеток M. tuberculosis и вегетативных клеток микобактерий, находящихся в макрофагах, что обусловлено значительным накоплением эндогенных порфиринов
• Обнаружено, что полидиаллиламины обладают бактерицидным действием как на активные, так и на покоящиеся микобактерии, благодаря их способности связываться с мембранами бактерий и формировать комплексы с нуклеиновыми кислотами

4. Продемонстрирована эффективность новой противотуберкулезной вакцины на основе аттенуированого по генам rpf штамма M.tuberculosis на мышиной модели

СОСТАВ ЛАБОРАТОРИИ

1. Kaprelyants A.S., Kell, D.B. Do bacteria need to communicate with each other for growth? — Trends In Microbiol., 1996, 4: 237-242.
2. Bavesh D. Kana , Bhavna G. Gordhan, Katrina J. Downing, Nackmoon Sung, Galina Vostroktunova, Edith E. Machowski, Liana Tsenova, Michael Young, Arseny  Kaprelyants, Gilla Kaplan, Valerie Mizrahi. The resuscitation-promoting factors of Mycobacterium tuberculosis are required for virulence and resuscitation from dormancy but are collectively dispensable for growth in vitro. — Molecular Microbiology, 2008, v.67, p.672-684
3. Kell D.B., Kaprelyants A.S., Grafen A. On  pheromones,  social behaviour and the functions  of secondary metabolism in bacteria. — Trends In Ecology And Evolution., 1995, 10: 126-129
4. Demina G.R., Makarov V.A., Nikitushkin, V.D., Ryabova O.B. Finding of the Low Molecular Weight Inhibitors of Resuscitation Promoting Factor Enzymatic and Resuscitation Activity. — Plos One, 2009, 4, еВ174
5. Mukamolova_GV, Kaprelyants_AS, Young_DI, Young_M, Kell_DB. A bacterial cytokine. — Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America, 1998, 95:.8916-8921
6. Mukamolova GV.,  Kaprelyants AS, Kell DB& Young M. Adoption of the transiently non-culturable state- a bacterial survival strategy? — Advances In Microb.Physiol, 2003, 47, 65-129
7. Galina V. Mukamolova, Alexey G. Murzin, Elena G. Salina, Galina R. Demina, Douglas B. Kell, Arseny S. Kaprelyants, Michael Young. Muralytic activity of Micrococcus luteus Rpf and its relationship to physiological activity in promoting bacterial growth and resuscitation. — Molecular Microbiology, 2006, v.59, p.84-98
8. Kell_DB, Kaprelyants_AS, Weichart_DH, Harwood_CR, Barer_MR. Viability and activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical issues. Antonie Van Leeuwenhoek International Journal Of General And Molecular Microbiology. — 1998, 73: 169-187
9. Kaprelyants, AS; Mukamolova, GV; Davey, HM. Quantitative analysis of the physiological heterogeneity within starved cultures of Micrococcus luteus by flow cytometry and cell sorting. — Applied And Environmental Microbiology, 1996, 62, 1311-1316
10. Shleeva M., Mukamolova G., Young М, H.Williams and Kaprelyants A.S. Formation of “non-culturable” cells of Mycobacterium smegmatis in stationary phase in response to growth under suboptimal conditions and their Rpf-mediated resuscitation. — Microbiology-UK, 2004, 150, 1687-1697
11. Downing KJ, Mischenko VV, Shleeva MO, Young DI, Young M, Kaprelyants AS, Apt AS, Mizrahi V. (2005) Mutants of Mycobacterium tuberculosis lacking three of the five rpf-like genes are defective for growth in vivo and for resuscitation in vitro. Infect Immun. 73(5):3038-43
12. Demina GR, Makarov VA, Nikitushkin VD, Ryabova OB, Vostroknutova GN, Salina EG, Shleeva MO, Goncharenko AV, Kaprelyants AS. (2009) Finding of the low molecular weight inhibitors of resuscitation promoting factor enzymatic and resuscitation activity. PLoS One, 4(12):e8174
13. Shleeva MO, Kudykina YuK, Vostroknutova GN, Suzina NE, Mulyukin AL, Kaprelyants AS. (2011) Dormant ovoid cells of Mycobacterium tuberculosis formed in response to gradual external acidification. Tuberculosis, V. 91, № 2, p. 146-154
14. Кудыкина Ю.К., Шлеева М.О., Арцатбанов В.Ю., Сузина Н.Е., Капрельянц А.С. (2011) Образование покоящихся форм Mycobacterium smegmatis в пост-стационарной фазе при постепенном закислении среды, Микробиология,  80 (5), 625-636
15. Арцатбанов В.Ю., Вострокнутова Г.Н., Шлеева М.О., Гончаренко А.В., Зинин А.И., Островский Д.Н., Капрельянц А.С. (2012) Влияние окислительного и нитрозативного стрессов на накопление дифосфатных интермедиатов немевалонатного пути синтеза изопреноидов у корино- и микобактерий. Биохимия. 77(4), 461-473
16. Nikitushkin VD, Demina GR, Shleeva MO, Kaprelyants AS. (2013) Peptidoglycan fragments stimulate resuscitation of «non-culturable» mycobacteria. Antonie Van Leeuwenhoek.  103 (1): 37-46
17. Shleeva M, Goncharenko A, Kudykina Y, Young D, Young M, Kaprelyants A. (2013) Cyclic AMP-dependent resuscitation of dormant Mycobacteria by exogenous free fatty acids. PLoS One. 8(12): e82914
18. Shleeva M, Kondratieva T, Rubakova E, Vostroknutova G, Kaprelyants A, Apt A. (2015) Reactivation of dormant “non-culturable” Mycobacterium tuberculosis developed in vitro after injection in mice: Both the dormancy depth and host genetics influence the outcome. Microbial Pathogenesis, 78, р. 63-66
19. Timofeeva LM, Kleshcheva NA, Shleeva MO, Filatova MP, Simonova YuA, Ermakov YuA, Kaprelyants AS. (2015) Nonquaternary poly(diallylammonium) polymers with different amine structure and their biocidal effect on Mycobacteria tuberculosis and smegmatis. Applied Microbiology and Biotechnology, 99 (6): 2557-71
20. Nikitushkin VD, Demina GR, Shleeva MO, Guryanova SV, Ruggiero A, Berisio R, Kaprelyants AS. (2015) A product of Rpf and Rip joint enzymatic action promotes resuscitation of the dormant mycobacteria. FEBS Journal, 282 (13): 2500-11
21. Nikitushkin VD, Shleeva MO, Zinin AI, Trutneva KA, Ostrovsky DN, Kaprelyants AS. (2016) The main pigment of the dormant Mycobacterium smegmatis is porphyrin. FEMS Microbiol Lett.  т.363, fnw206
22. Shleeva MO, Trutneva KA, Demina GR, Zinin AI, Sorokoumova GM, Laptinskaya PK, Shumkova ES, Kaprelyants AS. (2017) Free Trehalose Accumulation in Dormant Mycobacterium smegmatis Cells and Its Breakdown in Early Resuscitation Phase. Front Microbiol. 8:524
23. Shleeva MO, Kondratieva TK, Demina GR, Rubakova EI, Goncharenko AV, Apt AS, Kaprelyants AS. (2017) Overexpression of Adenylyl Cyclase Encoded by the Mycobacterium tuberculosis Rv2212 Gene Confers Improved Fitness, Accelerated Recovery from Dormancy and Enhanced Virulence in Mice. Front Cell Infect Microbiol. 7:370
24. Demina GR, Nikitushkin VD, Shleeva MO, Makarov VA, Riabova OB, Lepioshkin AYu, Kaprelyants AS. (2017) Benzoylphenyl thiocyanates are new, effective inhibitors of the mycobacterial Resuscitation promoting factor B protein. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 16(1):69
25. Trutneva K.A, Shleeva MO, Nikitushkin VD, Demina GR, Kaprelyants AS. (2018) Protein composition of Mycobacterium smegmatis differs significantly between active cells and dormant cells with ovoid morphology. Front. Microbiol., 9:2083
26. Shleeva, M.O., Savitsky, A.P., Nikitushkin, V.D., Solovyev ID, Kazachkina NI, Perevarov VV, Kaprelyants AS. (2019) Photoinactivation of dormant Mycobacterium smegmatis due to its endogenous porphyrins. Appl Microbiol Biotechnol 103, 9687–9695
27. Nikitushkin, V.D., Trenkamp, S., Demina, G.R., Shleeva M.O., Kaprelyants A.S. (2020) Metabolic profiling of dormant Mycolicibacterium smegmatis cells’ reactivation reveals a gradual assembly of metabolic processes. Metabolomics 16(2):24
28. Trutneva KA, Shleeva MO, Demina GR, Vostroknutova GN and Kaprelyans AS (2020) One-Year Old Dormant, “Non-culturable” Mycobacterium tuberculosis Preserves Significantly Diverse Protein Profile. Front. Cell. Infect. Microbiol. 10:26
29. Shleeva M, Savitsky A, Kaprelyants A. Corynebacterium jeikeium Dormant Cell Formation and Photodynamic Inactivation. Front Microbiol. 2020; 11:605899
30. Kondratieva T, Shleeva M, Kapina M, Rubakova E, Linge I, Dyatlov A, Kondratieva E, Kaprelyants A, Apt A. Prolonged infection triggered by dormant Mycobacterium tuberculosis: Immune and inflammatory responses in lungs of genetically susceptible and resistant mice. PLoS One. 2020;15(9):e0239668
31. Bychenko O, Skvortsova Y, Ziganshin R, Grigorov A, Aseev L, Ostrik A, Kaprelyants A, Salina EG, Azhikina T. Mycobacterium tuberculosis Small RNA MTS1338 Confers Pathogenic Properties to Non-Pathogenic Mycobacterium smegmatis. Microorganisms. 2021;9(2):414
32. Grigorov A, Bychenko O, Salina EG, Skvortsova Y, Mazurova A, Skvortsov T, Kaprelyants A, Azhikina T. Small RNA F6 Provides Mycobacterium smegmatis Entry into Dormancy. Int J Mol Sci. 2021 Oct 26;22(21):11536
33. Shleeva M, Savitsky A, Kaprelyants A. Photoinactivation of mycobacteria to combat infection diseases: current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol. 2021;105(10):4099-4109

1. Тестирование антибактериальной активности (бактерицидной и бактериостатической, определение МИК) новых химических соединений на уникальных моделях  активного и латентного туберкулеза in vitro
2. Определение видовой принадлежности бактерий по 16s РНК